ACE2在不同物種間的同源性分析及其對2019-nCoV宿主范圍的啟示

李彥君，陳嬌珊，趙 錦，聞子鈺，孫彩軍

新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)疫情暴發以來，在全球迅速蔓延，已造成超過410萬人感染。長期以來冠狀病毒家族成員與人類和動物疾病密切相關，可感染包括豬、牛、馬、駱駝、貓、狗、蝙蝠、兔子、雪貂、水貂、蛇、嚙齒動物、鳥類、和其他野生動物[1]。冠狀病毒科按其遺傳特性分為4個屬，其中α和β屬僅能感染哺乳動物，而γ和δ屬可感染禽類和哺乳動物等[1]。2019-nCoV 屬于冠狀病毒科β冠狀病毒屬[2]，近期的基因組學分析表明2019-nCoV 是一種自然進化的產物[3]。由于近期陸續報道了幾起動物的核酸檢測陽性事件[4-5]，2019-nCoV 由人向動物傳播的風險也引起了人們的關注。盡管尚缺乏確鑿的證據，但從理論上說這些動物與人類處于同一水平面對病毒，也有被感染的可能性[6]。基于2019-nCoV 已經在人群廣泛流行，人類感染者是否能通過呼吸道等途徑再傳染給人類密切接觸的動物，造成該疾病成為長期存在的人獸共患病，這將是一個值得關注的科學問題。

人類血管緊張素轉化酶2(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)包含805個氨基酸，由N端肽酶結構域(peptidase domain，PD)和C端凝集素樣結構域(collectrin-like domain，CLD)組成[7-8]。病毒表面S蛋白的受體結合域(receptor-binding domain, RBD)利用其外部區域與受體ACE2的PD結構域(19-615殘基)結合，介導病毒進入宿主細胞[8-9]。同時ACE2在新冠肺炎的發病中也可通過對腎素-血管緊張素系統產生負性調節，從而保護肺免受2019-nCoV所致的損傷[8,10]。因此，ACE2在COVID-19的傳播和疾病的病理中起關鍵作用。本文系統分析了不同物種ACE2蛋白的同源性，并討論了動物感染模型和潛在的易感動物，這將對實現人類-動物-生態的同一健康理念(One Health)以及預測預警重大疫情的流行和演變至關重要。

1 材料與方法

1.1研究對象 人類和30種與人類活動相對關系密切的動物ACE2全長氨基酸序列(1-805)。124種脊椎動物的ACE2-PD氨基酸序列(19-615殘基)。人類ACE2中與SARS-CoV接口的18個氨基酸：24Q、27T、31K、34H、37E、38D、41Y、42Q、45L、79L、82M、83Y、90N、325M、329F、330W、353L、354G[11]，人類ACE2中與2019-nCoV接口的8個氨基酸為24Q、30D、34H、41Y、42Q、82M、353L、357G[12]。

1.2數據來源與選擇 基于NCBI網站的Protein數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/)，以“ACE2”為關鍵詞，篩選條件設置為：SPECIES 選擇“animals”，SOURCE DATABASES選擇“RefSeq”，下載不同物種ACE2氨基酸序列。124種脊椎動物中包含哺乳類75種、鳥類23種，魚類18種 爬行類7種和兩棲類1種。根據經驗哺乳類動物與人類的同源性較高，進一步將其分為靈長目16種、奇/偶蹄目11種、食肉目23種、嚙齒目11種、翼手目7種、兔形目2種和其他類別8種。通過查閱文獻獲取人類ACE2中與SARS-CoV和2019-nCoV接口的20個氨基酸[11-12]。

1.3軟件和網站 氨基酸序列同源性比對使用NCBI網站的在線程序BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。采用MEGA 7軟件中的ClustalW 進行序列對齊，截取與人ACE2-PD 結構域(19-615位殘基)的對應序列。系統發育樹的構建使用MEGA 7軟件，采用鄰接法(NJ，Neighbor-joining)，參數設置為 Bootstrap 1000個循環。使用在線程序iTOL(http://itol.embl.de/)修改樹枝和字體的顏色。

2 結 果

2.1不同物種間ACE2氨基酸全長序列對比 與人類活動相對關系密切的30種動物ACE2全長氨基酸序列系統發育分析表明(圖1)，相比于魚類、鳥類和爬行類動物，哺乳類動物間的ACE2同源性更高。21種哺乳類動物可主要分為2個分支，刺猬單獨為一類，人類、非人靈長類、食肉類、嚙齒類等動物為第二類。與人類并列的2個小類分別為：貓科動物、犬科動物、穿山甲構成第一小類；奇蹄與偶蹄類動物和蝙蝠構成第二小類。BLAST氨基酸序列對比顯示，與鳥類、魚類、兩棲動物和爬行動物相比，人類ACE2全長氨基酸序列與哺乳動物更相似，高達80%以上，其中大猩猩99%，獼猴97%。

2.2不同物種間ACE2-PD氨基酸序列對比 進一步擴大不同種類動物樣本的序列數據，納入了124種脊椎動物的ACE2氨基酸序列，分析與2019-nCoV病毒S蛋白結合的ACE2肽酶結構域(ACE2-PD)序列的同源性。結果如圖2，PD結構域序列在不同物種間的同源性分析結果大致與圖1中的ACE2全序列分析一致。值得注意的是，與ACE2全長序列分析相比較，圖2中貓科動物和反芻動物與人的識別率有所增加，而蝙蝠有所下降。

圖1 AEC2氨基酸序列系統發育樹(NJ法，Bootsrtap1000個循環，n=31)Fig.1 Phylogenetic tree of AEC2 amino acid sequences (NJ method, Bootsrtap1000 cycles, n=31)

圖2 AEC2-PD結構域氨基酸序列系統發育樹(NJ法，Bootsrtap1000個循環，n=124)Fig.2 Phylogenetic tree of amino acid sequences in ACE2-PD domain (NJ method, Bootsrtap1000 cycles, n=124)

2.3不同物種間ACE2與S蛋白直接相互作用接口氨基酸對比 如表1，相對于人類ACE2的20個殘基，獼猴與人類完全一樣。家牛和家羊中的這20個殘基的變異性僅為3個氨基酸。家貓、雙峰駱駝和單峰駱駝中，在該位置有5個氨基酸的差異。蝙蝠的這20個氨基酸中有5個氨基酸與人類不同，而穿山甲的為7個。此外，家犬、野豬和家鼠在該位置的突變分別為6、6、8個氨基酸，而在禽類，如綠頭鴨、家雞以及羅非魚中的變異性均大于9個氨基酸。

表1 ACE2中與SARS-CoV及2019-nCoV RBD接口的20個氨基酸在不同物種中的保守性比較Tab.1 Comparison of conservation of 20 amino acids in ACE2 interface with SARS-CoV and 2019-nCoV RBD in different species

3 討 論

ACE2在動物界中廣泛表達，在哺乳動物中具有保守的一級結構，ACE2的這種保守性可能反映了其在腎素-血管緊張素系統中的重要作用。ACE2受體與病毒S蛋白RBD直接作用的接口氨基酸中，除部分靈長類動物與人類完全相同外，其他物種均有一定程度的不同(表1)。然而先前的研究表明S蛋白RBD與ACE2相互作用可以“容忍”受體中一定程度的變異。例如，在與SARS-CoV病毒S蛋白RBD相互作用的18個ACE2殘基中，獼猴、倉鼠、貓的受體在該區域含有≤4個氨基酸的變異，但仍可被SARS-CoV所識別；而果子貍和浣熊ACE2受體中觀察到了大于7個氨基酸的替代，還可被SARS-CoV所識別[11]。

潛在的動物模型：非人靈長類動物與人類ACE2氨基酸全長序列以及ACE2-PD氨基酸序列的同源性最為接近，獼猴與人類ACE2的20個殘基完全一樣。這提示非人靈長類動物可以作為研究2019-nCoV的良好動物感染模型。事實上，靈長類動物模型如獼猴[13-15]、食蟹猴[16]，感染2019-nCoV顯示出與人類相似的癥狀，包括病毒載量的變化、肺部CT影像，研究者們已經使用這些動物模型進行疫苗和藥物的篩選實驗[17]。氨基酸序列分析表明嚙齒類動物與人類同源性高，僅次于非人靈長類動物。小型嚙齒類動物具有容易飼養，維護成本低等優點，是醫學研域最常用的模型。然而，2019-nCoV在大鼠和小鼠中的復制效率很低，可能是由于小鼠ACE2受體在353位含有賴氨酸到組氨酸的突變，導致缺乏賴氨酸殘基所產生的關鍵親水相互作用[11]；大鼠ACE2也含有這種K353H突變，并且在N82處具有潛在的N-糖基化位點，它消除了受體對SARS-CoV-S的結合能力[11]。我們的研究(表1)也表明家鼠在接口氨基酸突變較多(8個)，不太可能通過ACE2受體感染。值得關注的是，金黃色西伯利亞倉鼠模型[18]和人類ACE2轉基因小鼠模型[19-20]已顯示出了希望的前景。

潛在的中間宿主：有文獻報道蝙蝠和穿山甲可能為2019-nCoV的中間宿主[21]，因為在這些動物體內發現了與感染人類的2019-nCoV同源性很高(>95%)的冠狀病毒[2, 22]，但由于不能確定感染的時間順序，仍存在爭議。本文的研究顯示穿山甲的20個接口氨基酸中有7個與人類不同，變異性較大。以往的研究表明蝙蝠進化出了一些特殊的免疫機制，機體不會產生強烈的炎癥反應以保證免疫系統不對病毒入侵采取過激反應，以達到和多種病毒如埃博拉病毒、狂犬病病毒、MERS-CoV、SARE-CoV等和平相處的狀態，是多種病毒的儲存庫[23]。相比于ACE2氨基酸全長序列分析，蝙蝠與人的識別率在ACE2-PD結構域序列分析中略有下降，20個接口氨基酸中蝙蝠有5個變異。因此，還需要提供更多證據來證明穿山甲和蝙蝠是否為2019-nCoV的中間宿主。

潛在的易感動物：我們的分析表明貓科動物和奇/偶蹄目動物與人類ACE2的一級結構具有較高的同源性。在家貓，雙峰駱駝和單峰駱駝(中東呼吸綜合征病毒(MERS-CoV)的宿主)中，接口氨基酸只有5個差異，從而提示這些動物有較大感染的可能性。最近，石正麗團隊調查了與人類密切接觸的動物和雪貂對2019-nCoV的敏感性，發現2019-nCoV在狗、豬、雞和鴨中的復制能力很差，但在雪貂和貓中卻能有效復制，并可以通過呼吸道飛沫在貓之間傳播[4]。該團隊進一步檢測了武漢市COVID-19暴發后的102份貓血清樣本，表明在暴發期間已感染武漢的貓群，COVID-19患者擁有的3只貓的中和抗體滴度最高[5]。2020年4月6日美國農業部動植物衛生檢驗局確認動物園中一只圈養老虎2019-nCoV核酸檢測呈陽性，并出現干咳和食欲下降等癥狀。貓、雪貂、老虎同屬于貓科動物，可能是2019-nCoV的易感動物，這與我們的分析結果相吻合(表1)。考慮到貓是與人類接觸非常密切的伴侶動物，因此應該引起格外關注。同樣值得關注的是，在家牛和家羊中的這20個殘基的變異性僅為3個氨基酸，與Joana Damas等[24]的研究相符合，提示反芻動物可能也有利于2019-nCoV的跨物種傳播，然而目前的研究卻很少關注這類動物。因此，我們建議有關部門應開展易感動物的病原學檢測。

其他動物：禽類，如綠頭鴨、家雞以及羅非魚中的變異性較大，提示與2019-nCoV病毒S蛋白的結合效率可能相對較低，因此這些家禽類動物感染此類病毒的可能性較低。

新冠病毒造成的全球大流行給人類健康和經濟發展造成了巨大影響，目前仍無有效的特效藥物和預防性疫苗。不同物種間ACE2的同源性分析對建立2019-nCoV動物感染模型、跨物種傳播、保護潛在易感動物等提供理論依據。目前，已報了6種有希望的SARS-CoV-2動物感染模型，包括人ACE2轉基因小鼠模型[19-20]、金黃色西伯利亞倉鼠模型[18]、雪貂模型[4, 25]、獼猴模型[13-15]和食蟹猴模型[16]等。這些動物模型的開發對于疫苗的評價和藥物的篩選至關重要。近年來暴發的一系列新發和再發人獸共患病，嚴重威脅著人類健康。然而，當前對于動物流行病學的常態化監測和風險評估仍相對滯后。因此，積極推進動物流行病學分析，不僅有助于深刻理解病原體與不同物種間的關系從而為溯源工作奠定基礎，也將對建立人類-動物-生態的同一健康理念(One Health)的全方位新型公共衛生防御體系具有重要的指導意義。

利益沖突：無