紅螯螯蝦累代繁養群體的遺傳多樣性分析

彭 剛，徐 宇，張 燕，王 靜，黃鴻兵，嚴維輝，許志強

( 江蘇省淡水水產研究所，江蘇 南京 210017 )

紅螯螯蝦(Cheraxquadricarinatus)，屬節肢動物門，甲殼綱，十足目，擬螯蝦科，光殼蝦屬[1]，體色為褐綠色或綠色，雄性成蝦第一步足大螯的外側頂端有一鮮紅、柔軟的膜質帶[2]，紅螯螯蝦原產澳大利亞北部，個體大，食性雜，耐低氧，養殖當年即可上市，我國于1992年由湖北水產研究所引進該品種進行小規模試養。隨著人們對其基礎生物學特性不斷研究，養殖技術不斷完善，紅螯螯蝦在國內養殖范圍逐步擴大，在海南、廣東、浙江、江蘇、湖北等地均有養殖成功的案例[3-4]，紅螯螯蝦國內引進近30年，許多地區已建立了自己的繁育基地，實現了保種越冬、自繁自養。

線粒體細胞色素氧化酶亞基Ⅰ(COⅠ)基因位于線粒體DNA中，是線粒體基因組13種氨基酸編碼序列之一，中度保守，進化速率適中，既能保證足夠的變異又易于擴增，且很少存在插入與缺失，適合種群水平差異的檢測[5-6]。近十年來，COⅠ基因被廣泛應用于物種分類及種內種間遺傳分化研究[7-11]。目前國內大部分紅螯螯蝦的繁養基地主要依賴于自有群體的養殖繁殖，經過多代的自繁自育后其遺傳多樣性如何，國內較少見文獻報道，僅謝雁南[12]對3個地區的紅螯螯蝦開展了群體遺傳學分析。為有效評估國內不同地區繁養基地紅螯螯蝦種質資源狀況，分析遺傳多樣性及遺傳分化水平，項目組采集了6個主要繁養區域的紅螯螯蝦，基于線粒體DNA COⅠ基因序列對不同群體的遺傳多樣性進行初步評估，為后續開展紅螯螯蝦的培育以及選育工作積累數據資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用紅螯螯蝦于2018年10—12月采自國內6個紅螯螯蝦繁養區，分別為安徽阜陽、浙江湖州、廣東珠海、江蘇鎮江、海南澄邁、江蘇蘇州，樣本采集量均為100尾以上，每個群體隨機取30尾用于后續的群體遺傳學分析。

1.2 方法

1.2.1 DNA模板制備

取紅螯螯蝦尾部肌肉組織，常規酚—氯仿法提取基因組DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA的完整性，紫外分光光度法檢測樣品DNA含量及純度。

1.2.2 PCR擴增及序列測定

參照紅螯螯蝦COⅠ基因序列(GenBank：HG942364.1)設計引物用于線粒體COⅠ基因擴增和序列測定。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，COⅠ-F: 5′-TTGTGTTCGGAGCCTGAT-3′; COⅠ-R: 5′-AGAAGGTCTTCCTGGTAGG-3′。對每個樣本的線粒體 COⅠ基因序列進行擴增，PCR反應體系為25 μL：模板DNA 25 ng，2×PCR Mix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，ddH2O補足體積。反應程序為：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，經30個循環再72 ℃延伸5 min。擴增產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，以標準DL2000 Ladder(TAKARA)估算產物大小。PCR擴增產物直接送生工生物工程(上海)股份有限公司測序獲取序列信息。

1.2.3 數據統計與分析

通過雙向測序獲得紅螯螯蝦線粒體COⅠ序列，經SeqManⅡ(DNASTAR Inc)軟件拼接并進行人工核查和校正，所獲序列用Clustal X軟件進行比對，用Mega 6.0軟件中的Kimura雙參數法計算遺傳距離。用Modeltest 3.16計算位點間堿基替代率的Gamma分布參數，并以鄰接法構建分子系統樹。通過單倍型多樣性和核苷酸多樣性分析當前不同繁養區紅螯螯蝦群體的遺傳多樣性。

2 結果與分析

2.1 序列變異特征分析

共獲取了6個紅螯螯蝦群體共180個樣品的線粒體COⅠ基因序列，對其進行對比分析，比對長度為831 bp，其中變異位點為56個，變異比率為6.7%，簡約信息位點16個，單核苷酸多態性位點76個。平均A、T、G、C堿基含量分別為27.840%、32.395%、14.848%、24.917%。紅螯螯蝦線粒體COⅠ基因G+C(%)含量較低39.765%，表現出較為明顯的堿基組成偏倚性。

在6個群體180個樣本中共檢測出 10 種單倍型(表1)。安徽阜陽群體與江蘇蘇州群體、海南澄邁3個群體間有2個共享單倍型 (H1/H3)。單倍型H1出現次數最多，為浙江湖州以外的5個群體的共享單倍型，單倍型 H2、H5、H7以及H10分別為安徽阜陽、海南澄邁、浙江湖州以及江蘇蘇州群體所特有的單倍型。

表1 紅螯螯蝦6個群體COⅠ基因單倍型(H1～H10)的分布

遺傳多樣性結果表明，本試驗中所涉及的紅螯螯蝦群體均具有較高的遺傳多樣性(表 2)，其總體單倍型多樣性指數為0.693，核苷酸多樣性指數為0.00652。其中，江蘇蘇州群體的單倍型多樣性指數最高(0.964)，海南澄邁群體最低(0.618)，核苷酸多樣性指數以浙江湖州群體最高(0.01587)，海南澄邁群體最低(0.01219)。

表2 紅螯螯蝦6個群體遺傳多樣性指數

2.2 群體結構及分子遺傳變異

6個紅螯螯蝦群體間的遺傳距離為0.00403～0.00969(表3)。其中海南澄邁群體和安徽阜陽群體間的遺傳距離較大，為0.00969，廣東珠海群體和江蘇蘇州群體間的遺傳距離最小，為0.00403。其中安徽阜陽群體與其他5個群體間的遺傳距離均較遠。

表3 紅螯螯蝦6個群體間的遺傳距離

以鄰接法構建的系統關系圖顯示，江蘇蘇州群體和浙江湖州群體首先聚為一支，并逐漸與江蘇鎮江、海南澄邁、廣東珠海群體聚集，安徽阜陽群體單獨為一支(圖1)。

圖1 紅螯螯蝦6個群體的聚類分析

3 討 論

3.1 紅螯螯蝦COⅠ基因片段變異及特征分析

紅螯螯蝦原產于澳大利亞北部及昆士蘭西北部地區，我國最早于1992年由湖北水產研究所引進，1998年浙江湖州突破了紅螯螯蝦規模化人工繁殖技術，目前江蘇、浙江、廣東、海南等地是我國紅螯螯蝦的主要養殖地區。多年來，由于群體引進記錄不完善，國內不同繁養群體的遺傳特征(特別是不同群體間的親緣關系)尚未被系統研究，紅螯螯蝦養殖過程中又存在無序留種、單一群體累代繁殖等問題，養殖過程中相繼出現病害頻發等現象。為解決種群退化問題，國內相關企業已多次從國外引進紅螯螯蝦對國內繁養群體進行種質更新。在紅螯螯蝦引種過程中，由于不同批次引進群體的遺傳特征數據尚未獲取，無序引種一方面造成了巨大的資金浪費，同時也限制了國內已有繁養群體的應用潛力。因此，對國內不同繁養基地已有紅螯螯蝦群體進行遺傳特征分析，獲取其遺傳多樣性及不同群體間的親緣關系數據，對于有效利用國內已有紅螯螯蝦種質資源具有重要的意義。

謝雁南[12]利用微衛星分子標記對國內廈門、廣州、崇明3個紅螯螯蝦養殖群體進行了遺傳多樣性分析，發現3個群體的平均表觀雜合度為0.648～0.679，平均期望雜合度為0.535～0.567，平均多態信息含量為0.451～0.480，每個點位等位基因數為2～7，養殖群體尚未出現種質退化。線粒體基因組具有結構簡單、分子小、進化快等特征，遵循嚴格的母系遺傳，幾乎不發生重組，不同區域的進化速度存在差異，而被廣泛應用于種群遺傳分化及多樣性的研究[13-14]，本試驗遺傳多樣性分析結果表明，國內紅螯螯蝦累代繁育群體均具有較高的遺傳多樣性，這與上述謝雁南[12]得出的養殖群體尚未出現種質退化結論基本相同。究其原因，主要與該品種引入國內時間較短，同時部分繁養基地由于前期繁養不成功，會從其他繁養基地或澳大利亞、中國臺灣補充少量種蝦，群體間的基因交流也有效保持了各群體均具有較高的遺傳多樣性。6個群體中海南澄邁群體和廣東珠海群體單倍型多樣性較低，推測或因紅螯螯蝦在該地區繁養環境條件較為適宜，養殖經驗較為豐富，基本解決“繁養推”一體化，多年的自繁自養等因素導致其遺傳多樣性相對較低。浙江是國內較早攻克紅螯螯蝦室內人工苗種繁育技術的地區，該地區苗種的供給比較成熟，有相對獨立的親本引繁體系。試驗中發現，浙江繁養群體缺乏H1單倍型，推測浙江群體與其他群體間的基因交流相對較少，而且該單倍型可能來源于最新從國外引進的紅螯螯蝦群體。

3.2 不同繁育基地紅螯螯蝦遺傳距離及交流情況

Nei[15]認為，群體間的遺傳距離為0.00～0.05。本研究中6個紅螯螯蝦群體間的遺傳距離為0.00403～0.00969，低于李吉濤等[16]測定的脊尾白蝦(Exopalaemoncarinicauda)渤海灣、萊州灣、膠州灣、海州灣4群體間的遺傳距離(0.0153～0.0345)。由6個群體間遺傳距離結果來看，由于交流頻繁，廣東珠海群體和江蘇蘇州群體間遺傳距離最小，同時由于地緣關系江浙一帶群體間遺傳距離也較小，但安徽阜陽群體與其他5個群體間的遺傳距離均較遠，推測與其親本引進渠道及外界交流較少有關。紅螯螯蝦在江浙等內陸地區不能自然繁殖，無法自然進行種群的擴散繁衍，其種質的保存與更新完全依賴人為的干預。

3.3 紅螯螯蝦資源的保護與利用

養殖業會受到長期近親繁殖帶來的產量下降等一系列影響[17]，本試驗結果初步表明，目前我國紅螯螯蝦繁養群體遺傳多樣性水平仍然較高，但隨著養殖規模的擴大和養殖行業的推進，紅螯螯蝦長期自繁自養的弊端可能會逐步凸顯，如何加強對種質資源的評估和繁育群體多樣性的保護更新，對推動紅螯螯蝦產業長期健康穩定發展具有重要的現實指導意義。