4種水產藥物對寬體金線蛭幼苗的急性毒性研究

郭 坤，羅鳴鐘，阮國良，魏 巍，李 銳

( 1.長江大學，濕地生態與農業利用教育部工程研究中心，湖北 荊州 434025； 2.浙江省農業科學院，省部共建農產品質量安全國家重點實驗室(籌)，浙江 杭州 310021 )

寬體金線蛭(Whitmaniapigra)，俗稱水蛭、螞蝗、肉鉆子等，《中華人民共和國藥典》收錄的藥用水蛭的主要基原動物，屬環節動物門、蛭綱、無吻蛭目、黃蛭科、金線蛭屬[1]，是我國重要的水生經濟動物。以寬體金線蛭為主要原料的醫藥制品，具有預防和治療心腦血管疾病的特殊功效，其藥用價值得到極大的提高[2-3]。醫藥市場對寬體金線蛭的需求主要來源于野生環境，然而由于過度捕撈和水域生態環境惡化等原因，野生寬體金線蛭資源出現匱乏，我國已有部分地區開始進行人工養殖[4]。

目前，對寬體金線蛭養殖生態學的研究主要集中在人工繁殖[5-9]、苗種培育[10-11]、養殖[12-13]等方面，已取得一系列成果，促進了寬體金線蛭規?；B殖。然而，由于高密度的養殖，養殖水體環境不良，經常暴發疾病，給養殖生產帶來了較大的損失。關于安全用藥方面的研究較少，水產動物對藥物的敏感性差異較大，在疾病的預防和治療中若劑量不當則可能會給養殖對象造成傷害甚至死亡。筆者通過研究硫酸銅、聚維酮碘、高錳酸鉀、辛硫磷4種常用水產藥物對寬體金線蛭的急性毒性作用，旨在為寬體金線蛭合理用藥和健康養殖提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

寬體金線蛭幼苗由長江大學水生經濟動物研究中心提供，采回后放于實驗室120 L水族箱中暫養7 d，用水為充分曝氣的自來水，水溫(25.0±1.5) ℃，pH 7.2～7.8，溶解氧(6.0±0.5) mg/L。供試寬體金線蛭幼苗身體健壯，活動正常，平均體質量(0.062±0.006) g。

硫酸銅(天津市北辰方正試劑廠，有效成分99%)、聚維酮碘(武漢天辰生物科技有限公司生產，有效成分10%)、高錳酸鉀(鄭州中天實驗儀器有限公司，有效成分99%)、辛硫磷(武漢中博水產生物技術有限公司，有效成分40%)，4種水產藥物按有效質量濃度配置試驗液。

1.2 試驗方法

寬體金線蛭具有前后兩個吸盤，爬行能力較強。為防止其在毒性脅迫過程中爬離藥液而造成結果的偏差，本研究中采用10 cm×10 cm×5 cm的80目封閉性網袋作為容器，網袋頂部設置一拉鏈結構的開口，用于放入和取出寬體金線蛭。網袋放置在40 cm×50 cm×30 cm的塑料水箱中，網袋頂部四角系一尼龍繩，尼龍繩另一端固定在水箱上，以固定網袋。水箱中液體高度為10 cm，完全淹沒網袋，以保證寬體金線蛭在試驗過程中一直在藥液中，同一處理的3個網袋放于同一水箱中，水溫為(25.0±1.5) ℃，其他水質指標與暫養期間相同。

急性毒性試驗參照文獻[14]的方法，選擇5個間距較大的藥物質量濃度進行預試驗，觀察寬體金線蛭在96 h內的活動情況，得出24 h全部死亡的最低質量濃度和96 h未出現死亡的最高質量濃度，根據此結果按照等對數間距設置正式試驗的質量濃度。每種藥物設置5個質量濃度梯度組(表1)和1個空白對照組，每個網袋放入10尾寬體金線蛭，每組設置3個平行。為保證容器中藥液劑量的穩定，高錳酸鉀和聚維酮碘處理組每隔12 h更換一次藥液，其余組別每隔24 h更換一次。試驗開始的前6 h連續觀察寬體金線蛭的活動情況并記錄，及時清理死亡個體，以后在24、48、72、96 h時記錄成活數。死亡的判斷標準為：用玻璃棒輕觸靜止不動的寬體金線蛭，5 min無任何反應，則判斷為死亡。

表1 4種水產藥物的試驗質量濃度 mg/L

1.3 統計分析

采用寇式法(Karber)計算半致死質量濃度(LC50)、安全質量濃度(SC)和半致死質量濃度的95%置信區間(CI)，并做試驗質量濃度對數為橫坐標與死亡率為縱坐標的直線回歸方程[15]，利用藥物毒性蓄積程度系數(MAC)來分析寬體金線蛭體內對藥物的蓄積和降減變化[16]，相關計算公式如下：

LogLC50=Xm-d(∑p-0.5)

SC=48 h LC50×0.3/(24 h LC50/48 h LC50)2

95%CI=LogLC50±1.96×d[∑(pg/n)]0.5

MAC=(t2LC50-t1LC50)/(t0LC50-tmLC50)×100%

式中，LC50為半致死質量濃度(mg/L)，SC為安全質量濃度(mg/L)，95%CI為半致死質量濃度95%置信區間(mg/L)，MAC為藥物毒性蓄積程度系數(%)，Xm為最大質量濃度的對數，d為相鄰質量濃度的對數差值，p為死亡率(%)，∑p為各組死亡率之和，g為存活率(%)，n為每組試驗個數；t1LC50和t2LC50為觀察時段t1和t2的半致死質量濃度值(mg/L)，t0LC50和tmLC50分別為試驗初始、結束時半致死質量濃度(mg/L)。

2 結 果

2.1 中毒癥狀

各處理組，寬體金線蛭幼苗的中毒癥狀基本類似。試驗初期，各處理組的寬體金線蛭幼苗均表現出興奮的狀態，不停游動，高質量濃度組(處理Ⅳ和Ⅴ)表現更加的興奮，瘋狂游動。3 h后，4種藥液高質量濃度組的(處理Ⅳ和Ⅴ)寬體金線蛭幼苗變得安靜，停留在網袋底部，寬體金線蛭身體開始卷曲并出現少量蛻皮，5 h后，低質量濃度組的寬體金線蛭也表現出類似的癥狀。6 h后，4種藥液高質量濃度組的部分幼苗身體出現腫塊和黏液分泌量增多，此外，硫酸銅和辛硫磷高質量濃度處理組的部分寬體金線蛭還出現吸盤充血和雄性生殖器外露的現象。8 h后，4種藥液高質量濃度組的寬體金線蛭體色由茶褐色變為灰白色。大部分寬體金線蛭在毒性處理后臨近死亡時，體表出現一層無色透明的黏液或身體末端掛著未脫離的皮。

2.2 4種常用水產藥物對寬體金線蛭幼苗的急性致死效應

由表2可知，在96 h的急性毒性試驗過程中，對照組的寬體金線蛭幼苗均未出現死亡情況，各質量濃度處理組寬體金線蛭的死亡率均隨藥物質量濃度的增加和試驗時間的延長而上升。低質量濃度的高錳酸鉀對寬體金線蛭幼苗的急性致死效應較小，96 h的死亡率低于30%。4種藥物最高試驗質量濃度對寬體金線蛭幼苗的急性致死效應均較大，96 h各組死亡率均達100%。

表2 4種水產藥物對寬體金線蛭幼苗的致死率

2.3 4種水產藥物對寬體金線蛭幼苗的毒性效應

根據相關計算公式[17]得出硫酸銅、聚維酮碘、高錳酸鉀及辛硫磷對寬體金線蛭幼苗的半致死質量濃度、半致死質量濃度的95%置信區間、藥物毒性蓄積程度系數和安全質量濃度(表3)。半致死質量濃度均隨試驗時間的延長而下降，硫酸銅、聚維酮碘、高錳酸鉀及辛硫磷對寬體金線蛭幼苗的24 h半致質量濃度分別為0.579、78.173、3.956、0.978 mg/L，48 h半致死質量濃度分別為0.389、67.898、3.327、0.836 mg/L，72 h半致死質量濃度分別為0.280、62.747、2.703、0.611 mg/L，96 h半致死質量濃度分別為0.241、56.058、2.313、0.493 mg/L。其安全質量濃度依次為：硫酸銅0.053 mg/L<辛硫磷0.183 mg/L<高錳酸鉀0.706 mg/L<聚維酮碘15.367 mg/L。4種常用水產藥物對寬體金線蛭幼苗的藥物毒性蓄積程度系數隨著試驗時間的延長表現出不同的變化趨勢。

表3 4種水產藥物對寬體金線蛭幼苗的急性毒性特征分析

根據藥物質量濃度對數和死亡率—概率單位的關系計算出4種藥物24、48、96 h的回歸方程(表4)。

表4 4種水產藥物對寬體金線蛭幼苗急性毒性的回歸方程分析

3 討 論

3.1 4種藥物對寬體金線蛭幼苗的急性毒性比較

半致死質量濃度是衡量藥物對動物急性毒性作用強弱的關鍵指標，半致死質量濃度與藥物毒性負相關[17]。通過試驗得知4種常用水產藥物對寬體金線蛭幼苗24、48、72、96 h的半致死質量濃度值，但實際生產中多采用96 h半致死質量濃度來確定藥物對水生動物的急性毒性大小。根據國家環?？偩职l布的毒性分類標準[18]，急性毒性96 h半致死質量濃度<0.1 mg/L為劇毒，0.1～1.0 mg/L為高毒，1.0～10.0 mg/L為中毒，>10.0 mg/L為低毒。

本研究結果顯示，硫酸銅和辛硫磷對寬體金線蛭幼苗的96 h半致死質量濃度分別為0.241、0.493 mg/L，均屬高毒。高錳酸鉀的96 h半致死質量濃度為2.313 mg/L，屬中毒。聚維酮碘的96 h半致死質量濃度為56.058 mg/L，屬低毒。這4種藥物對寬體金線蛭幼苗的毒性依次為硫酸銅>辛硫磷>高錳酸鉀>聚維酮碘。

3.2 4種藥物在寬體金線蛭幼苗體內的蓄積與降減的特征分析

藥物毒性蓄積程度系數常作為生物對毒物敏感程度差異的指示參數，來分析生物體對藥物的蓄積與降減動態[19]。其值越大，即毒效蓄積幅度越大，生物抗毒能力下降，致死率就越大；其值大于0時，蓄積作用強度大于降減作用，反之亦然。

由表3可知，硫酸銅和聚維酮碘的藥物毒性蓄積程度系數在24～48 h出現最大值，而高錳酸鉀和辛硫磷的藥物毒性蓄積程度系數值在48～72 h出現最大值，表明4種藥物的毒性分別在這兩個時間段在寬體金線蛭體內蓄積作用較強，即為死亡高峰階段；過此階段后，藥物毒性蓄積程度系數出現下降，表明寬體金線蛭對藥物的抵抗能力上升，毒性減弱。通過比較4種藥物的藥物毒性蓄積程度系數，發現寬體金線蛭對高錳酸鉀在各試驗階段的蓄積幅度變化不大，表明其毒性蓄積較強，降解毒性能力較差；在試驗48～96 h寬體金線蛭對硫酸銅和辛硫磷的藥物毒性蓄積程度系數下降明顯，硫酸銅試驗72～96 h的藥物毒性蓄積程度系數是24～48 h的45.57%，辛硫磷試驗72～96 h的藥物毒性蓄積程度系數是24～48 h的20.36%，說明其降解毒效能力較強，毒效蓄積速度下降。因此，在研究藥物對動物的毒性效應時，應當分析藥物毒性蓄積變化，充分考慮時效對其影響。

3.3 生產過程中幾種水產藥物的使用注意事項

硫酸銅是水產病害防治中的常用藥物，游離的銅離子能夠破壞氧化還原酶系統的活性，使酶失去活性而具有抗病原體的作用[20]。本試驗中硫酸銅對寬體金線蛭幼苗的安全質量濃度為0.053 mg/L，遠低于常用劑量0.5 mg/L，重金屬銅離子易在體內積累且溫度較高時毒性會加大，從而引起機體血液、生理生化及組織病理等變化[21]，因此建議禁止硫酸銅作為寬體金線蛭病害防治的藥物。

聚維酮碘為常用的消毒劑，是通過氧化病原體原漿蛋白的活性基因，并與蛋白的氨基結合而使其變性，從而有效殺死細菌、真菌、病毒及原蟲等病原體[22-23]。在水產苗種繁育過程中聚維酮碘的常用量為2～5 mg/L，本試驗中聚維酮碘對寬體金線蛭幼苗的安全質量濃度為15.367 mg/L，大于常規劑量。因此聚維酮碘作為寬體金線蛭幼苗養殖過程中消毒劑可以安全使用。

高錳酸鉀是一種強氧化劑，通過釋放新生態氧，迅速氧化有機物，而起到殺菌、殺蟲的作用，常用于防治魚蝦等細菌、真菌和寄生蟲類疾病及設施、工具的消毒[24]。本試驗中高錳酸鉀對寬體金線蛭幼苗的安全質量濃度為0.706 mg/L，小于生產上高錳酸鉀全池潑灑的劑量(1～2 mg/L)。因此，建議除對養殖設施和工具的消毒外，在寬體金線蛭培育過程中應謹慎使用高錳酸鉀，如使用建議采用短時間浸泡方法，并注意用藥時間和觀察寬體金線蛭的行為。

辛硫磷是一種高效低毒的有機磷殺蟲劑，在防治寄生蟲性疾病中發揮重要作用，通過抑制膽堿脂酶活性，引起乙酰膽堿代謝紊亂，引起神經中毒，常用劑量為10 μg/L[25]。然而，當其劑量超過水產動物的安全用量時，會通過影響機體抗氧化系統干擾生物體的功能[26]。本研究結果顯示，辛硫磷對寬體金線蛭幼苗的安全質量濃度為0.183 mg/L，高于常用劑量。因此，在常用劑量范圍內，可以作為寬體金線蛭疾病防治的藥物。