四川寶興圈養綠尾虹雉的人工孵化技術研究

張敬，馬紅，安俊輝，李非平，李淑紅，鄧江宇，張成林，侯蓉，John Corder

(1.北京動物園圈養野生動物技術北京市重點實驗室，北京100044；2.四川寶興蜂桶寨國家級自然保護區管理局，四川寶興625700；3.成都大熊貓繁育研究基地，成都610081；4.世界雉類協會，英國諾森伯蘭郡NE47 8DL)

綠尾虹雉Lophophoruslhuysii屬雞形目Galliformes雉科Phasianidae虹雉屬，為我國特有高山雉類，分布于甘肅東南部、西藏東北部、青海東南部、云南西北部和四川；終年生活于林線以上，多見于海拔3 500～4 200 m的高山草甸、灌叢和裸巖地帶，尤其偏好多陡崖和巖石的高山灌叢和灌叢草甸(盧汰春，1991)。世界自然保護聯盟(IUCN)瀕危物種紅色名錄將綠尾虹雉列為易危(VU)物種，瀕危野生動植物種國際貿易公約(CITES)將其列入附錄Ⅰ；綠尾虹雉被列為我國國家Ⅰ級重點保護野生動物，被《中國脊椎動物紅色名錄》評估為瀕危(EN)物種(蔣志剛等，2016)。遷地保護方面，1955年綠尾虹雉最早在北京動物園圈養展出并逐漸開始繁殖(李福來，1989)，隨后的幾十年間國內外研究人員相繼在人工繁育技術、繁殖行為和疾病的預防治療等方面開展了一些研究(Rimlinger &Witman，1986；Kuehler &Lieberman，1989；程彩云等，1993，1996；陶玉靜，陳輝，1999)。由于綠尾虹雉的高原特性，多年來在遷地保護過程中面臨著諸多難點，2014年后，除四川寶興維持一個小規模人工種群外，其他地區的圈養個體相繼死亡(張敬等，2019a)。因此，有必要繼續加強綠尾虹雉人工繁育的研究，為將來開展遷地保護提供條件。

四川寶興蜂桶寨綠尾虹雉保護研究中心(簡稱研究中心)成立于1992年，2017年有11只個體，由于孵化設備和技術的限制，卵的孵化率一直較低(張敬等，2019a)。2018—2019年進行了綠尾虹雉卵人工孵化研究，探索卵的最佳孵化方案并積累經驗。

1 材料與方法

1.1 種鳥及飼養

實驗用卵來自研究中心圈養的4組種鳥，由2004年野外個體及其后代組成。飼養方式：非繁殖期，1只雄鳥與1～3只雌鳥同籠飼養；繁殖期，1雌 1雄配對后同籠單獨飼養。產卵后將卵撿出，進行人工孵化和育雛。飼養籠舍長10.0 m×寬3.5 m×高2.8 m。每日喂食2次，飼料有：雞蛋、面包蟲、白菜、折耳根、西紅柿、洋蔥、大蒜、玉米、商品顆粒飼料，繁殖期前補充鈣質。

1.2 研究方法

我國動物園鳥卵人工孵化始于20世紀60年代，孵化溫度主要采用家禽孵化中“看胎施溫”的方法控制，用測量卵的水分散失率和氣室大小調節孵化濕度(李福來，1989；張敬等，2017)。對多種鳥卵孵化的實踐發現，大多數鳥卵在孵化過程中水分散失，會減少初始重量的12%～15%，如果通過稱量卵失重的方法來監測孵化，增加或減少孵化機內部濕度，將這個損失控制在個別物種的要求范圍內，卵成功孵化的可能性將會大大提高(Harvey，1993；Brown &Robbins，2002；張敬等，2019b)。人工孵化時使用2臺或多臺孵化機，在不同的濕度下運行，根據卵的質量曲線讀數將卵轉移到不同濕度孵化機中孵化。這種技術被應用在鸚鵡、雉類、企鵝和走禽類的人工孵化中，都取得了理想的效果(Brown &Robbins，2002；張敬等，2019b)。因此，本研究采用不同濕度孵化綠尾虹雉卵，旨在探索不同濕度對卵孵化結果的影響，同時尋找綠尾虹雉成功孵化的最佳卵失重范圍。

1.3 卵的收集、保存和入孵前的準備

研究期間一共收集了37枚卵進行人工孵化，其中僅有17枚受精卵，其中，2018年8枚，2019年9枚。對卵進行編號、測量，保存在17～21 ℃、相對濕度50%～60%的室內，垂直放置在已消毒的蛋托盤上，保存時間不超過24 h。卵的入孵在每天13∶00。入孵前對卵表面進行清潔，清潔后的卵放入事先調試好的預熱箱中預熱2～3 h，預熱箱30～35 ℃，相對濕度50%，然后轉入孵化機內孵化。

1.4 孵化設備和方法

孵化設備有孵化機、出雛機(8015 Compact MP GTFS 84型，Grumbach)、預熱機(8104 BSS MP GTFS 160型，Grumbach)、電子天平(精確度0.000 1 g)、除濕機(MD-150E，美菱)。

孵化機分別命名為主孵化機、1號和2號孵化機。孵化溫度均設定為37.5 ℃；孵化濕度分別設定為：主孵化機50%～55%，1號和2號孵化機分別為30%和80%。卵側放在蛋架上，自動翻卵設置為：每2 h 1次，每次30 min，翻動180°。5枚卵孵化失敗，因此將12枚卵分為2組，梯度濕度組的6枚卵先放在主孵化機中孵化，在孵化過程中以15%卵失重率計算值和曲線作為標準，比較每天卵的質量變化，用主孵化機、1號和2號孵化機孵化：在每次稱量卵質量后計算出卵的實際質量損失，如果卵每日質量損失大于15%失重率理論計算值，就將卵轉移到2號孵化機中，若實際質量損失小于理論計算值，則將卵轉移到1號孵化機中，當實際質量損失趨于或與理論計算值相符，則移回或仍在主孵化機中繼續孵化；均衡濕度組的6枚卵一直在主孵化機中孵化。

孵化期間，每日13∶00稱量卵質量。孵化7 d后使用照蛋器驗卵，每2 d 1次，肉眼觀察并記錄胚胎發育情況。稱量和驗卵過程一般不超過 1 min。晾卵隨每天稱重或驗卵進行，時間一般為5～10 min。卵孵化26 d左右，胚胎喙進入氣室后，卵被轉入出雛機中直到雛鳥出殼，出雛機溫度設定為36.5 ℃，濕度70%～80%。原則上胚胎啄殼48 h 后不能自行出殼時進行人工輔助出殼。

1.5 數據采集和分析

孵化過程中采集和記錄：卵指數(長徑、短徑、卵質量)、開始孵化日期、出殼日期、啄殼時間、是否進行人工輔助出殼等，并記錄每次驗卵情況。使用Excel 2013對數據進行計算和分析，繪制卵失重曲線；采用配對樣本的t檢驗對梯度濕度組和均衡濕度組卵的胚胎的啄殼時間、卵孵化期、卵的失重率和初始雛重數據進行差異性分析；用一元線性回歸進行 2組卵失重率與初始雛重之間的相關性分析，以及卵平均質量與孵化天數之間的相關性分析。所有數據均在SPSS中進行分析。

2 結果

2.1 卵質量比較

卵呈卵圓形，卵殼呈暗棕黃色或土黃色，具有大小不同的紫褐色斑點。將37枚卵的卵指數與前人研究(李福來等，1985；Kuehler &Lieberman，1989；程彩云等，1993；陶玉靜，陳輝，1999)、野外記錄(盧汰春等，1986；Heetal.，1988)進行了比較(表1)，其中有3枚卵由于破損，缺少數據。

表1 不同圈養單位和野外綠尾虹雉卵指數對比Table 1 Comparison of the egg index of Lophophorus lhuysii in captivity and wild

2.2 孵化數據統計

17枚受精卵中有5枚卵孵化失敗，卵的孵化率為70.6%。12只雛鳥3個月內的成活率為100%。12枚卵的啄殼時間最早出現在第26.1天，最晚為第28.3天，平均為(27.4±0.6) d。雛鳥從啄殼到完全出殼的時間最短為36.5 h，最長為58.5 h，平均為(48.7±6.8) h。孵化期最短為28.1 d，最長為30.2 d，平均為(29.5±0.6) d；自然出殼的有4枚，自然出殼率為33%；失重率最小為10.7%，最大為17.6%，平均為14.0%±2.0%(表2，圖1)。

圖1 12枚圈養綠尾虹雉卵的質量曲線Fig.1 Mass curve of 12 eggs of Lophophorus lhuysii during incubation

孵化期間，卵質量(y)與孵化天數(x)呈極顯著負相關關系：y=-0.414 8x+82.882 0(r2=0.999 6，P<0.01)(圖2)。

2.3 不同濕度對孵化的影響

梯度濕度組和均衡濕度組在胚胎啄殼時間和卵孵化期的差異無統計學意義；而在卵的失重率(P=0.034)和初始雛重(P=0.015)的差異有統計學意義。卵失重率與初始雛重之間存在極顯著負相關性關系(r=-0.797，P=0.002)。

2.4 胚胎發育過程概述

通過驗卵對12枚卵的胚胎發育進行觀察和記錄。參照家雞卵胚胎發育特征描述(鐘兆紅，羅明玉，2011)，不同時期綠尾虹雉卵胚胎發育特征概括如下：

第1天：卵黃表面有1個顏色較深、周圍稍亮的圓點。

第7天：卵黃表面可見明顯的“蜘蛛狀血管”。

第8天：胚胎邊緣出現許多紅點。

第9天：卵黃囊血管區形狀似櫻桃。

第10天：卵黃囊血管區形狀像蚊子。

第11天：轉動卵時卵黃不易跟隨轉動，舌開始形成，機體的器官均形成。

第12天：可見黑色的眼點，可分辨出雌雄性腺，心臟完全形成。

第13天：胚胎形狀像“電話筒”，一端是頭部，一端是軀干部，可見胚胎有規律運動，喙和卵齒開始形成。

第14天：胚胎沉在羊水中。

第17天：尿囊血管在卵小頭合攏，除氣室外，整個卵都布滿了血管，胚胎腿上的鱗片和腳趾開始形成。

第24天：以小頭對準光源，已看不到發亮的部分，肺血管形成，但無血液循環。

第25天：氣室向一側傾斜，胚胎眼睛開始睜開，轉身，喙朝向氣室。

第27～28天：卵黃囊全部被吸入腹腔內，喙刺破殼膜，深入氣室內，肺呼吸開始，隨后啄殼。

第29～30天：聽見叫聲，胚胎繞卵殼繼續啄殼1圈，雛鳥破殼而出。

3 討論

3.1 卵失重范圍

在卵孵化開始設定濕度時，如果不確定，可以從相對濕度55%開始(Brown &Robbins，2002；張敬等，2019b)。對于一些雉類卵來說，從孵化開始到胚胎喙進入氣室之前這段時間，可以維持這個濕度；但對于一些特定物種或特殊卵，如厚殼卵或卵殼孔隙度低的卵，要達到理想的卵失重率，實際孵化時采用的濕度可能會有很大差異(Brown &Robbins，2002；張敬等，2019b)。在人工孵化時應該為特定物種或某些特殊卵殼的卵提供不同的孵化濕度，以保證卵達到理想的失重率。通過查閱文獻，本研究為綠尾虹雉卵提供了高低不同的梯度式孵化濕度，在一定范圍內對卵的失重進行了控制，2018—2019年成功孵化的12枚卵的平均卵失重率為14.0%。綜上所述，綠尾虹雉卵在人工孵化時可保持卵失重率在10%～15%，使失重趨近于12%。

3.2 不同孵化方法對雛鳥出殼時間的影響

梯度濕度組和均衡濕度組的差異性分析結果顯示，綠尾虹雉卵失重率越小，雛鳥初生質量越大，這必定影響出殼期間胚胎在卵殼內的旋轉和破殼的進程，從而對雛鳥的出殼時間產生較大影響，但在孵化末期，卵殼內胚胎的喙頂破卵胎膜進入氣室的時間較難觀察記錄，雛鳥完全出殼的時間也有可能記錄不夠精確，而影響最后的分析結果，所以本研究沒有涉及2組的出殼時間的差異性分析，這有待在今后的孵化試驗中進行比較和驗證。

致謝：世界雉類協會專家Richard Edgell、David Rimlinger、Laurent Fontaine、Alain Hennache和Bernard Giboin；北京師范大學生命科學學院張正旺、王鵬程為項目的研究、方法和數據分析提供了幫助；四川寶興蜂桶寨國家級自然保護區管理局楊玉君、左琳為項目開展提供了支持，侯艷、陳黎參與了項目工作；北京大興瀕危動物馴養繁殖中心程彩云、陶玉靜，北京動物園孟彤提供了孵化技術經驗；北京動物園重點實驗室賈婷、由玉巖為項目提供了幫助，謹此一并致謝。