HPLC 法測定薏米中兩種植物甾醇

商云帥，馮 梅，王 東，楊玉民,*

（1.吉林工商學院糧食學院，吉林 長春 130507；2.長春職業(yè)技術學院，吉林 長春 130033）

薏米又稱薏苡仁，是薏苡去殼后的種仁，中國傳統(tǒng)食藥兩用的植物，在歐洲被稱為生命健康之禾，在日本被列為防癌健康食品，更享有世界禾本植物之王的美譽。薏米味道甘淡，屬寒性，有利水滲濕、健脾止瀉和排膿等功效[1-2]。薏米營養(yǎng)豐富，約含有65%碳水化合物，17%蛋白質(zhì)，5%脂肪。除了三大能量物質(zhì)之外，薏米還含有多種活性成分，其中植物甾醇的含量在同類植物中居高[3-4]。植物甾醇是一種營養(yǎng)價值高、生物活性強，與動物甾醇結構相似的植物類固醇物質(zhì)。植物甾醇主要包括β-谷甾醇、菜油甾醇和豆甾醇等，呈片狀或粉末狀，為白色固體，不溶于水、酸或堿，溶于有機溶劑[5]。由于植物甾醇能夠抑制吸收低密度脂蛋白膽固醇，對人體具有較強的抗炎作用，多被用于降低膽固醇的保健食品[6]。此外，植物甾醇對許多慢性病，如糖尿病、心血管疾病、肝炎等有良好的抑制性，也是重要甾體藥物和維生素D3的生產(chǎn)原料[7-11]。但人體細胞無法內(nèi)源合成植物甾醇，只能從植物性食物中獲取，因此植物甾醇作為備受關注的食品功能性因子廣泛應用在食品、醫(yī)藥等領域[12]。

植物甾醇只能從外源食物中獲得，而薏米含有豐富的甾醇類化合物，研究薏米植物甾醇的提取及分析極有必要。目前植物甾醇的檢測方法主要有氣相色譜法、薄層色譜法、紅外光譜分析法、紫外分光光度法、高效液相色譜法等[13-14]。其中薄層色譜法操作復雜、耗時長且溶劑使用量大；紅外光譜分析法誤差大、靈敏度低且對樣品的純度有較高的要求；紫外分光光度法只能測定總甾醇的含量，無法測定各甾醇單體的含量；氣相色譜法前處理復雜，需進行衍生化預處理。高效液相色譜法不需衍生化可直接進樣，方法快速準確、重復性好，目前應用較為廣泛。張冬陽[15]對薏米中β-谷甾醇的提取、分離、純化及其功能性進行研究，采用高效液相色譜法測定薏米中β-谷甾醇含量，方法具有靈敏度高、精密度高的特點，但局限于一種植物甾醇的測定，不適用于多種植物甾醇的分離。馮文歡等[16]建立了HPLC-UV 法測定植物甾醇中3 種甾醇單體含量的方法，該方法便捷準確，加標回收率好，但是存在樣品局限性大、程序運行時間較長等問題。為建立多組分植物甾醇快速、簡便、準確的高效液相色譜法，本研究以薏米為原料，采用超聲輔助提取法提取薏米中豆甾醇和β-谷甾醇，進行方法學研究，通過優(yōu)化流動相配比、柱溫、流速等色譜條件，建立適合薏米中兩種植物甾醇的定性定量分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

薏米：產(chǎn)地吉林省。

豆甾醇、β-谷甾醇標準品（純品型），北京萬佳首化生物科技有限公司產(chǎn)品；甲醇（色譜純），美國Fisher公司產(chǎn)品。

1.1.2 儀器與設備

U3000 型高效液相色譜儀，KQ-500E 型超聲波清洗機，SC-3610 型低速離心機，HH-6 型數(shù)顯恒溫水浴鍋，GZX-9070MBE 型恒溫干燥箱，F(xiàn)A2004N 型電子天平，JY7114 型粉碎機。

1.2 方法

1.2.1 薏米中兩種植物甾醇提取的工藝流程

薏米干燥→研磨過篩→稱量→加入有機溶劑→超聲輔助提取→離心→取上清液水浴揮干溶劑→甲醇定容至10 mL→經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾至進樣小瓶→上機分析

1.2.2 操作要點

準確稱取一定質(zhì)量的薏米樣品于離心管中，加入一定體積的提取溶劑，水浴超聲提取后離心處理，將上清液置于恒溫水浴鍋中，待溶劑揮干后用甲醇將待測物質(zhì)定容至10 mL，過0.22 μm 微孔濾膜后上機測定，計算薏米樣品中豆甾醇和β-谷甾醇的提取量。

1.2.3 試驗方案設計

試驗從不同提取溶劑、料液比、溶劑濃度、提取溫度、提取時間、提取次數(shù)6 個單因素進行研究。不同提取溶劑分別為甲醇、乙醇、乙腈和正丁醇，此時溶劑濃度為 90%、料液比為 1∶30（g/mL）、提取溫度 45 ℃、超聲提取 40 min、提取 1 次；料液比分別為 1∶10、1∶20、1 ∶30、1∶40、1∶50（g/mL），此時提取溶劑為 90%乙醇、提取溫度45 ℃、超聲提取40 min、提取1 次；溶劑濃度分別為60%、70%、80%、90%、100%，此時料液比為1∶10（g/mL）、提取溶劑為乙醇、提取溫度 45 ℃、超聲提取 40 min、提取 1 次；提取溫度分別為 35、45、55、65 ℃，此時料液比為 1∶10（g/mL）、提取溶劑為 90%乙醇、超聲提取40 min、提取1 次；提取時間分別為20、30、40、50、60 min，此時料液比為 1∶10（g/mL）、提取溶劑為90%乙醇、超聲溫度35 ℃、提取1 次；提取次數(shù)為1、2、3、4 次，此時料液比為 1∶10（g/mL）、提取溶劑為90%乙醇、超聲溫度35 ℃、超聲提取50 min、提取1 次。

1.2.4 標準曲線的繪制

準備稱取豆甾醇和β-谷甾醇標準品各5 mg（精確至0.000 1 g），分別置于50 mL 容量瓶中，然后分別加入適量甲醇后超聲溶解，用甲醇定容至刻度，配制成標準濃度均為100 μg/mL 的豆甾醇標準儲備液和β-谷甾醇標準儲備液。分別準確吸取兩種標準儲備液 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 至 5 mL 容量瓶，充分混勻后甲醇定容，配制成 10、20、30、40、50 μg/mL 的混合標準使用液，上機測試。豆甾醇和β-谷甾醇標準品溶液濃度在10～50 μg/mL 內(nèi)呈線性關系，回歸方程分別為y=0.049 8x+0.011 3、y=0.054x+0.062 2，相關系數(shù)分別為 0.999 6、0.999 9。

1.2.5 方法檢出限

取1 μg/mL 的混合標準使用液，按優(yōu)化后的色譜條件進樣分析，3 倍信噪比即為方法檢出限，計算得到豆甾醇和β-谷甾醇的方法檢出限分別為0.270 μg/mL和 0.262 μg/mL。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

原始數(shù)據(jù)由賽默飛U3000 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)生成，試驗數(shù)據(jù)運用Excel 2013 軟件計算，圖譜由Origin Pro 9.0軟件生成。

2 結果與分析

2.1 高效液相色譜分析方法的建立

2.1.1 檢測波長的確定

分別取 2 mL 濃度為 100 μg/mL 的豆甾醇和β-谷甾醇標準溶液移入10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度線，配制成濃度為20 μg/mL 的混合標準使用液，利用紫外分光光度計在190～540 nm 波長范圍內(nèi)進行全波長光譜掃描，得到最大吸收波長為208 nm。

2.1.2 流動相配比的確定

在柱溫30 ℃、流速1.2 mL/min、檢測波長208 nm條件下進行等度洗脫，考察不同配比流動相對兩種甾醇分離效果的影響，結果如圖1 所示。以100%甲醇作為流動相，目標峰分離效果好，基線平穩(wěn)，峰型好，分析時間短，兩種植物甾醇在11 min 內(nèi)完全分離。單標和混標色譜圖比對可知，豆甾醇保留時間為9.343 min、β-谷甾醇保留時間為10.212 min。以A(99%甲醇)-B(1%水) 為流動相，出峰時間延遲且基線發(fā)生小幅波動；以A(98%甲醇)-B(2%水)為流動相，出峰時間延遲，導致運行時間變長，基線不穩(wěn)定；以A(97%甲醇)-B(3%水)為流動相，峰面積小、出峰慢，基線大幅波動。因此，以100%純甲醇為流動相，分離效果最好，對兩種植物甾醇分離有利。

2.1.3 柱溫的確定

在100%甲醇作為流動相、流速1.2 mL/min、檢測波長208 nm 條件下進行等度洗脫，考察不同柱溫對兩種甾醇分離效果的影響，結果如圖2 所示。柱溫分別為25、30、35、40 ℃，分析色譜圖可知，柱溫的變化對峰形、基線影響不大，差別在于柱溫越高，保留時間越短。綜合分離效果及能耗等因素，選擇30 ℃作為分離柱溫。

2.1.4 流速的確定

在100%甲醇作為流動相、柱溫30 ℃、檢測波長208 nm 條件下進行等度洗脫，考察不同流速對兩種甾醇分離效果的影響，結果如圖3 所示。流速分別為0.8、1.0、1.2、1.4 mL/min，分析色譜圖可知，流速的變化對峰形、基線影響不大，差別在于流速越大，保留時間越短，但同時柱壓也會增大。綜合分析時間和溶劑成本，選擇1.2 mL/min 作為分離流速。

2.1.5 色譜條件的確定

綜合分析試驗結果，確定測定兩種植物甾醇的最佳色譜分離條件為：色譜柱（C18，4.6 mm×250 mm×5 μm），流動相100%甲醇，柱溫 30 ℃，流速 1.2 mL/min，檢測波長208 nm，進行等度洗脫。

2.2 薏米中兩種植物甾醇提取

試驗采用超聲法提取薏米中的豆甾醇和β-谷甾醇，考察了提取溶劑、溶劑濃度、料液比、提取時間、提取溫度和提取次數(shù)等因素對提取量的影響，不同試驗條件下提取量結果如表1 所示。分析表1 數(shù)據(jù)可知，兩種植物甾醇在薏米中均有檢出，豆甾醇含量相對較低，β-谷甾醇含量相對較高。根據(jù)試驗結果可知，隨著料液比和提取溫度的增大，兩種植物甾醇提取量呈下降趨勢；溶劑濃度和提取時間對兩種植物甾醇提取量的影響呈現(xiàn)先升高后降低的變化；增加提取次數(shù)，提取量變化不大。綜合分析確定，提取量高且提取溫度低、提取時間短的最佳條件為：乙醇溶劑為90%，料液比 1∶10（g/mL），提取溫度 35 ℃，提取時間 50 min，提取次數(shù)1 次。此條件下進行6 次平行試驗驗證，得到薏米中β-谷甾醇提取量平均值為18.53 mg/100 g，豆甾醇提取量平均值為1.49 mg/100 g。

為了考察方法的準確度和精密度，進行了低、中、高三個水平的加標回收試驗，6 次平行試驗結果如表2 所示。薏米中β-谷甾醇的加標回收率平均值為97.9%～101.2%，相對標準偏差RSD 為3.3%～7.5%。豆甾醇的加標回收率平均值為89.8%～92.5%，相對標準偏差RSD 為3.2%～8.4%。試驗結果表明，該方法回收率良好，RSD 均小于10%，符合分析要求。

表1 不同提取條件試驗結果Table 1 Experimental results at different extraction conditions

表2 加標回收試驗結果(n=6)Table 2 Result of standard recovery tests(n=6)

3 結論

本試驗建立了超聲輔助提取-高效液相色譜法測定薏米中兩種植物甾醇即豆甾醇和β-谷甾醇含量的方法。通過優(yōu)化流動相配比、選擇柱溫及流速等試驗，確定了以100%甲醇為流動相，流速1.2 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長208 nm 的最佳色譜條件。方法學試驗表明，兩種植物甾醇在10～50 μg/mL 內(nèi)均呈良好的線性關系，相關系數(shù)分別為0.999 6、0.999 9。為充分提取薏米中的目標組分，采用超聲輔助提取法進行了多個單因素的考察，確定以濃度為90%的乙醇為提取溶劑，料液比 1∶10（g/mL），35 ℃水浴超聲 50 min提取1 次為最佳提取條件。樣品經(jīng)最佳提取條件進行前處理，按最優(yōu)儀器條件測得β-谷甾醇提取量為18.53 mg/100 g，豆甾醇提取量為1.49 mg/100 g。該方法操作便捷，適用性強，能夠同時滿足充分提取和準確定量薏米中兩種植物甾醇的要求。