不同發酵劑制得的發酵牛肉調味基料的抑菌性研究

吳晨燕，楊 梅，梁麗雅，馬儷珍,*

（1.天津農學院食品科學與生物工程學院，天津 300384；2.天津市強源食品有限公司，天津 301700）

傳統牛肉調味料以牛骨肉末為原料，經高壓浸提、酶解、美拉德反應制成，是天然熱反應肉味香精的一種[1]。發酵牛肉調味料（Fermented Beef Flavorings,FBF）以傳統制作工藝為基礎，在酶解和美拉德反應中間增加發酵環節制作而成[2]，發酵處理能提高牛肉調味料的風味[3]，且終產物有很好的抑菌性[4]。發酵時間和發酵劑種類的差異會影響終產物的形成。馬藝熒等[5]研究東北酸菜發酵時間對有機酸含量影響時發現，隨著發酵時間延長，有機酸含量明顯增加。王赫等[6]在研究發酵時間對乳酸菌發酵飼料中的主要營養物質含量影響時發現，發酵時間與飼料中的粗蛋白、氨基酸、蛋氨酸、乳酸菌活菌數、乳酸含量等均呈二次曲線關系，適宜的發酵時間會促進飼料中營養物質、乳酸菌、乳酸量的增加。陳忠軍等[7]研究乳桿菌產細菌素的發酵條件時發現，乳桿菌在發酵24 h 時抑菌活性最強，隨著發酵時間的延長抑菌活性下降[8]。不同發酵劑抑菌活性存在很大差異。有研究表明，植物乳桿菌、戊糖片球菌對金黃色葡萄球菌、李斯特菌、大腸桿菌、沙門氏菌均有較強的抑制效果，木糖葡萄球菌對上述四株致病菌的抑制作用較弱[9]。

課題組前期研究了15 種發酵劑發酵16 h 制備的FBF 的抑菌性差異，并篩選得到了抑菌效果較好的3 種發酵劑[4]，分別是WBL-45（木糖葡萄球菌+肉葡萄球菌+清酒乳桿菌）、VHI-41（木糖葡萄球菌+戊糖片球菌+植物乳桿菌）和清酒乳桿菌（Lactobacillus sake,LS）。為縮短FBF 的生產周期，試驗將發酵時間縮短至12 h，考察發酵12 h 和16 h 制得的FBF 之間的抑菌效果差異。試驗以WBL-45、VHI-41、LS 為研究對象，以金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,S.aureus）、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium, S.typhimurium）、大腸桿菌（Escherichia coli, E. coli）、乙型副傷寒沙門氏菌（Salmonella paratyphiB,S. para-typhiB）為指示菌。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

牛骨肉末（骨肉比 3∶7）、木糖、葡萄糖、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、維生素B1，頂興（天津）食品科技發展有限公司產品；WBL-45、VHI-41，意大利薩科公司產品；LS，薩科商業復合菌中分離純化獲得；純牛奶，內蒙古蒙牛乳業（集團）股份有限公司生產；MRS 液體培養基，北京索萊寶科技有限公司產品；風味蛋白酶、復合蛋白酶，丹麥諾維信公司產品；酵母提取物、胰蛋白胨、氯化鈉、氫氧化鈉，天津市風船化學試劑科技有限公司產品。

S.aureus（ATCC6538）、S.typhimurium（ATCC14028）、S.paratyphiB（ATCC50094）、E.coli，中國農業大學微生物實驗室提供。

1.1.2 儀器與設備

SX-500 型高壓蒸汽滅菌鍋，Friocell 22 型恒溫恒濕培養箱，3001-1339 VarioskanFlash 酶標儀，Bluepand恒溫搖床。

1.2 方法

1.2.1 菌種的活化及菌懸液的制備方法

WBL-45 和VHI-41 兩株商業復合發酵劑，使用前用滅菌純牛奶活化2 h。LS 發酵劑于MRS 液體培養基37 ℃連續活化3 代，于4 ℃貯藏備用。

S.aureus、S.typhimurium、E.coli、S.paratyphiB 接種于LB 液體培養基并置于37 ℃恒溫搖床中活化3代，于4 ℃貯藏備用。

1.2.2 FBF 的制備方法

1.2.2.1 工藝流程

原料選擇（冷凍牛骨肉末）→高壓浸提→酶解→發酵（或不發酵）→美拉德反應→離心

1.2.2.2 操作要點

（1）高壓浸提：將60 g 牛骨肉末與240 g 蒸餾水混合均勻，0.1 MPa、121 ℃下加熱 4 h。

（2）雙酶同步酶解：浸提液冷卻至室溫，分別添加質量分數0.06%的風味蛋白酶和0.03%的復合蛋白酶，于50 ℃振蕩4.5 h，酶解結束后沸水浴滅酶20 min。

（3）發酵：將 WBL-45、VHI-41、LS 分別接種至酶解液中，30 ℃下分別發酵12 h 和16 h，發酵結束后沸水浴滅菌20 min。商業復合發酵劑依照產品推薦量添加，添加量為牛骨酶解液質量的0.02%，單菌接種量為106CFU/mL。

（4）美拉德反應：每組在發酵液中添加1.2%木糖、1.2%葡萄糖、0.9%半胱氨酸、0.45%甘氨酸、0.45%丙氨酸、1.8%維生素B1，攪拌均勻后在110 ℃下美拉德反應60 min。

（5）離心：所有處理組4 ℃冷藏過夜，兩層紗布過濾去除牛油和骨渣，在2 ℃、5 000 r/min 條件下離心1 min，上清液4 ℃冷藏備用。

1.2.3 試驗方案設計

參照FBF 的制備工藝，只在發酵環節設計不同處理。試驗設計：①CK 組：不發酵；②發酵12 h：分別接種 WBL-45、VHI-41、LS 發酵劑發酵 12 h；③發酵16 h：在②的基礎上將發酵時間延長至16 h。通過測定 FBF 作用于E.coli、S.typhimurium、S.paratyphiB、S.aureus等指示菌的OD600nm，確定其抑菌性。

1.2.4 FBF 制備過程中pH 的測定

分別在高壓浸提、酶解、發酵、美拉德反應等環節結束后，取樣測定pH。

1.2.5 抑菌率的測定

指示菌于37 ℃，130 r/min 活化12 h，用無菌LB將其稀釋至濃度約為107CFU/mL。吸取FBF 10 μL 與90 μL 指示菌懸液進行混合。37 ℃反應12 h，測定600 nm 下的 OD指示菌+FBF值。同時進行空白對照和陽性對照，分別測定 600 nm 下的 ODLB、OD指示菌、ODLB+FBF。計算公式如下：

式中：ODLB為 100 μL LB 液體培養基在 600 nm 下的OD 值；OD指示菌為 100 μL 指示菌在 600 nm 下的 OD值；ODLB+FBF為 90 μL LB+10 μL FBF 在 600 nm 下的OD 值；OD指示菌+FBF為 90 μL 指示菌液+10 μL FBF 在600 nm 下的 OD 值。

1.2.6 數據處理

使用Excel 2016 處理數據，使用Sigma plot 10.0繪圖，用Statistix8.1 中Tukey HSD 進行顯著性檢驗（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 FBF 制備過程中pH 的變化

FBF 制備過程中pH 變化如圖1 所示。隨著各工藝環節的進行，各處理組pH 呈整體下降趨勢。發酵結束后，12 h 組和16 h 組FBF 的pH 變化規律均表現為 WBL-45＞LS＞VHI-41（P＜0.05），說明 VHI-41發酵劑在3 株發酵劑中產酸能力最強。觀察美拉德反應結束 pH 的變化，發酵 12 h 組（4.43～4.55）和 16 h組 FBF（4.28～4.48）顯著低于 CK 組（4.73）。對比 12 h組和16 h 組FBF 的pH 差異，發酵16 h＜發酵12 h，說明發酵處理能顯著降低FBF 的pH，隨著發酵時間的延長，FBF 的pH 降低更加顯著。其中VHI-41 發酵劑在3 株發酵劑中產酸能力最強，發酵12 h 和16 h的pH 均保持最低水平，其成品pH 分別為4.43 和4.28。

2.2 不同處理組對E.coli 抑菌率的影響

由圖2 可以看出，CK 組和發酵組對E.coli均呈現較好的抑制效果。CK 組對E.coli的抑菌率為60%，發酵組對E.coli的抑菌率為76%～86%，二者間差異顯著（P＜0.05）。3 種發酵劑中，VHI-41 組的抑菌效果最佳，發酵16 h 其抑菌率高達86%，與其他處理組差異顯著（P＜0.05）；發酵12 h 抑菌率為83%，與WBL-45 發酵12 h 組無顯著性差異。抑菌性最低的是LS組（發酵12 h 和16 h 其抑菌率分別為76%和79%）。發酵時間對抑菌率的影響因菌種不同而存在差異，VHI-41 發酵劑隨著發酵時間延長對E. coli的抑菌性顯著增加（P＜0.05），而其他2 種發酵劑隨發酵時間延長抑菌性變化不顯著。由此說明，VHI-41 組發酵16 h 制得的FBF 對E.coli的抑菌效果最好。

2.3 不同處理組對S.typhimurium 抑菌率的影響

由圖 3 可以看出，CK 組對S. typhimurium的抑制率僅達到4%，發酵后FBF 抑菌性顯著增強（P＜0.05），不同發酵劑對S. typhimurium的抑菌能力依次為：VHI-41＞LS＞WBL-45。發酵 12 h 組，VHI-41、LS、WBL-45 組FBF 抑菌率分別為 66%、58%、46%。發酵時間由12 h 延長至16 h 時，所有發酵組的抑菌率均顯著提高（P＜0.05），增幅最大的是WBL-45組，由46%（12 h）提高至 62%（16 h），增幅為 35%。由此說明，發酵劑的種類和發酵時間均對FBF 抑制S.typhimurium的能力產生較大影響，VHI-41 發酵16 h對S.typhimurium的抑制率為71.8%，在所有處理組中抑菌效果最好。

2.4 不同處理組對S.paratyphi B 抑菌率的影響

由圖4 可以看出，CK 組對S.paratyphiB 抑菌率在“0”刻度線以下，即傳統工藝制得的牛肉調味料對S.paratyphiB 沒有抑制作用。在制備過程中增加發酵環節，FBF 對S. paratyphiB 有顯著的抑制作用（P＜0.05）。相比較而言，無論發酵12 h 還是16 h，經 VHI-41 發酵制得的 FBF 對S. paratyphiB 抑菌率均達最高值（發酵12 h 為58%，16 h 為63%）。除VHI-41 之外，其余2 種發酵劑隨發酵時間延長制得的FBF 對S. paratyphiB 抑菌率增幅均較大，發酵12 h 時，WBL-45、LS 組抑菌率分別為 60%、69%，發酵16 h 其抑菌率分別上升至70%、76%。

2.5 不同處理組對S.aureus 抑菌率的影響

由圖5 可以看出，CK 組對S. aures的抑制率為25%。經3 種發酵劑發酵12 h 后，處理組對S.aureus的抑制率增強，VHI-41 組最高，達61%。當發酵時間延長至16 h 時，WBL-45 組增幅最大，抑菌率由52%（12 h）上升至 67%（16 h）。

3 討論

3.1 pH 動態變化和各處理組FBF 抑菌能力的相關性

對FBF 制作過程中pH 的動態變化進行監測，各發酵組FBF 的pH 明顯低于CK 組，且發酵時間延長，FBF 的 pH 明顯降低，其中 VHI-41 組 pH 始終維持在較低水平。觀察不同處理組對4 個指示菌的抑制情況，可以發現類似的趨勢，即各發酵組抑菌效果優于CK 組，發酵時間延長，抑菌能力提高。VHI-41 組抑菌效果最好，FBF 的抑菌能力可能與乳酸菌生長繁殖過程中提供的低pH 環境有關。

3.2 各處理組FBF 的抑菌差異分析

研究發現，肉品發酵過程中常見的細菌包括乳桿菌屬、片球菌屬、鏈球菌屬、微球菌屬以及葡萄球菌屬幾大類[10-11]，這些發酵劑可提高肉品安全性和風味[12-13]。試驗所采用的發酵劑包括WBL-45、VHI-41 和LS。其中木糖葡萄球菌和肉葡萄球菌因能促進肉品蛋白質和脂肪的水解常被用于改善肉制品色澤，提高肉品的食用品質[14]；清酒乳桿菌、植物乳桿菌則能有效降低肉制品中pH，抑制致病菌的生長[15-16]；此外，清酒乳桿菌的代謝產物細菌素也具有較好的抑菌性，目前已報道的清酒乳桿菌細菌素以Ⅱa 類細菌素為主，Ⅱa是分子量小于10 kDa 的小分子熱穩定肽[17]，可通過破壞細胞膜完整性，增大膜通透性，引起胞內營養物質外流，進而引起細胞死亡[18]。戊糖片球菌在發酵過程中同樣能降低環境pH[19]，產生耐熱、耐酸堿、具有廣譜抑菌性的細菌素，抑制致病菌和腐敗菌的生長繁殖[20]。對比3 組發酵劑組成，VHI-41 發酵劑中乳桿菌比例較高，這可能是VHI-41 發酵劑抑菌效果優于其他兩株發酵劑的原因。

4 結論

試驗研究3 組發酵劑發酵12 h 和16 h 制得的FBF 的抑菌性能差異。試驗結果表明：

（1）CK 組對S. aureus、S. typhimurium、E. coli的抑制率分別為25%、4%、60%，對S.paratyphiB 無抑制作用。發酵處理使得FBF 抑菌率上升。發酵12 h，各組 FBF 對S.aureus、S.typhimurium、E.coli、S.paratyphiB 的抑菌率分別為 52%～59%、46%～66%、76%～83%、60%～78%，隨著發酵時間的延長，各處理組抑菌率分別上升至 58%～67%、62%～71%、79%～86%、70%～83%。

（2）3 個發酵劑組中，隨著時間的延長，WBL-45組增幅最高，VHI-41 組的抑菌效果最好，發酵16 h對E. coli、S. typhimurium、S. paratyphiB、S. aureus指示菌的抑菌率分別達到86%、71%、63%、59%。對比VHI-41 組12 h 和16 h 的抑菌性差異發現，發酵時間對該發酵劑的抑菌性影響較小。

（3）在保證FBF 抑菌性的前提下，為縮短FBF 的生產周期，可選用VHI-41 發酵12 h 的工藝進行FBF的制作。