超臨界CO2 對(duì)哈密瓜汁中大腸桿菌的殺滅效果研究

侯思涵，陳計(jì)巒，裴龍英，李文新

（石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆 石河子 832003）

新疆是哈密瓜主要種植區(qū)。由于產(chǎn)區(qū)多分布在南北疆，遠(yuǎn)離內(nèi)地市場(chǎng)，鮮瓜運(yùn)輸和貯藏期間損耗很大，每年因腐爛變質(zhì)造成的損失達(dá)到25%～30%。因此，亟需開發(fā)哈密瓜保值增值技術(shù)，其中哈密瓜汁飲料是最具潛力的哈密瓜加工產(chǎn)品。哈密瓜是熱敏性水果，在熱殺菌過程中會(huì)產(chǎn)生大量的熱臭異味，嚴(yán)重影響了哈密瓜汁的正常風(fēng)味，哈密瓜在國際上還沒有成為果汁工業(yè)化生產(chǎn)的主要原料。因此，采用新型殺菌方法最大程度地保持哈密瓜汁原有風(fēng)味便成為哈密瓜汁加工生產(chǎn)中急需解決的問題。

超臨界二氧化碳（SCCO2）是廉價(jià)無毒的天然殺菌劑，能有效的殺滅微生物[1-5]，是一項(xiàng)綠色環(huán)保的非熱力殺菌技術(shù)。超臨界CO2技術(shù)不僅能有效殺滅食品中的腐敗微生物和病原微生物，還能保持食品的色澤、風(fēng)味和營養(yǎng)成分，克服熱力殺菌造成的營養(yǎng)成分損失和熱臭氣味的產(chǎn)生。近年來，國內(nèi)外利用超臨界二氧化碳對(duì)果蔬進(jìn)行滅菌已有文獻(xiàn)報(bào)道，但對(duì)哈密瓜汁采用超臨界CO2技術(shù)進(jìn)行殺菌的報(bào)道極少[6]。

本試驗(yàn)采用超臨界CO2對(duì)哈密瓜汁進(jìn)行處理，以哈密瓜汁中大腸桿菌為研究對(duì)象，研究超臨界CO2對(duì)哈密瓜汁中大腸桿菌的殺滅效果，結(jié)合細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的觀察和分析，探討超臨界CO2的殺菌機(jī)理，為哈密瓜汁等果蔬汁加工及超臨界CO2的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

哈密瓜：購于石河子農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，新鮮飽滿，成熟度均勻，可溶性固形物含量9%～11%。

哈密瓜汁：哈密瓜清理，去皮，去籽，切成2～3 cm的小塊，榨汁后用4 層紗布過濾兩次，用無菌瓶分裝，在4 ℃保存?zhèn)溆茫?/p>

大腸桿菌菌種：石河子大學(xué)食品微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基。

試劑：K2HPO4、KH2PO4、NaOH、NaCl、乙醇、戊二醛、環(huán)氧樹脂、丙酮、醋酸鈾均為分析純；二氧化碳純度為99.9%。

1.1.2 儀器與設(shè)備

219A-1171 型超薄切片機(jī)，H-600 型透射電鏡，超臨界設(shè)備（天津市華泰森淼生物工程技術(shù)有限公司HPP.L.2-600/0.6），電熱培養(yǎng)箱，打漿機(jī)，高速冷凍離心機(jī)，精密電子天平，生化培養(yǎng)箱，電子天平，滅菌鍋。

1.2 方法

1.2.1 大腸桿菌菌懸液的制備

漢晉之際，九品中正制確立、門閥制度盛行、莊園經(jīng)濟(jì)繁榮以及天人感應(yīng)神學(xué)體系崩潰，玄學(xué)思潮興盛，道家思想得到了復(fù)興、勃發(fā)，促進(jìn)了人的覺醒、藝術(shù)的自覺，推動(dòng)著藝術(shù)精神的獨(dú)立，都在客觀上催生了江南藝術(shù)世家的形成。值得注意的是，以瑯邪王氏、陳郡謝氏為代表的江南藝術(shù)世家，不僅有著深厚的藝術(shù)修養(yǎng)，而且以家族為單位踐行著家族式的藝術(shù)傳承，這對(duì)于漢魏六朝藝術(shù)的繁榮和發(fā)展有著重要意義，也深刻影響著后世藝術(shù)的創(chuàng)作與傳承。

大腸桿菌菌種接種到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中于37 ℃活化24 h，再接種到營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，于3 000 r/min 下離心10 min 后棄去上清液，菌體重新懸浮于一定量的生理鹽水中。基于預(yù)試驗(yàn)結(jié)果取100 mL接種到1 000 mL 哈密瓜汁中制成菌懸液，然后將其分裝于100 mL 的無菌大試管中，每管裝量50 mL[7-8]。

1.2.2 超高壓二氧化碳?xì)⒕幚?/p>

將超臨界設(shè)備的處理釜預(yù)熱到設(shè)定的溫度，然后將裝有50 mL 哈密瓜汁的試管置于處理釜中（釜提前經(jīng)過75%酒精消毒），關(guān)閉放氣閥，打開進(jìn)氣閥，經(jīng)過5～10 min 的升壓過程達(dá)到設(shè)定的壓力，哈密瓜汁在不同的壓力（10、20、35 MPa）和溫度（35、45、55 ℃）分別處理10～70 min，樣品處理結(jié)束后，關(guān)閉進(jìn)氣閥，打開放氣閥，經(jīng)過約15～20 min 卸壓，將哈密瓜汁取出，迅速加蓋冷卻[9-10]。

1.2.3 超臨界二氧化碳抑制哈密瓜汁中大腸桿菌的動(dòng)力學(xué)分析

在無菌操作條件下，按《食品微生物檢驗(yàn)國家標(biāo)準(zhǔn)》（GB 4789—2003），采用平板傾注計(jì)數(shù)法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。以無菌生理鹽水或者蒸餾水適當(dāng)稀釋超臨界CO2處理前后樣品，接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)24 h 后，菌落記數(shù)[11-12]。每一樣品取3 個(gè)稀釋度，不同稀釋度接種3 個(gè)平板，選取菌落數(shù)在30～300 之間的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。滅菌效果采用菌落存活對(duì)數(shù)lgNt/N0（Nt：處理t時(shí)間后每毫升活菌數(shù)；N0：初始菌濃度）表示。

超臨界CO2對(duì)哈密瓜汁中大腸桿菌的殺菌效果，用一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)公式分析：

式中：t表示處理時(shí)間（min），D為微生物（或芽孢）的活菌數(shù)減少90%所需要的時(shí)間（min），k為在給定壓力或溫度值時(shí)的滅菌速率常數(shù)（min-1）。

分別取經(jīng)超臨界CO2處理和未經(jīng)處理的大腸桿菌菌液50 mL，在離心管中以3 500 r/min 離心3～5 次（離心的轉(zhuǎn)速不能太大，以保證菌體不因?yàn)殡x心的機(jī)械運(yùn)動(dòng)而受損），吸取上清液，然后將沉淀的菌體轉(zhuǎn)移至0.5 mL 的微量離心管中，繼續(xù)以3 000 r/min 離心20 min。最后將沉淀的菌體用3%戊二醛固定，用pH為6.8 的磷酸緩沖液反復(fù)洗滌3～5 次，再以1%鋨酸固定過夜，然后用不同梯度（30%、50%、60%、70%、80%、90%）乙醇依次脫水，每次脫水15 min，再以95%乙醇脫水20 min，無水乙醇脫水兩次，每次20 min，丙酮脫水兩次，每次20 min，然后加入3∶1 的丙酮與環(huán)氧樹脂作用2 h，再加入1∶1 的丙酮與環(huán)氧樹脂作用4 h，加入純環(huán)氧樹脂滲透3 h，然后在50 ℃下以環(huán)氧樹脂包埋48 h。包埋后用超薄切片機(jī)切制70 nm 切片，放入230 目的銅網(wǎng)中。切片以醋酸鈾作用30 min 進(jìn)行染色，水洗后加入檸檬酸鉛作用20 min，水洗。于H-600 型透射電鏡下觀察。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Origin 7.5 軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 超臨界二氧化碳處理大腸桿菌的動(dòng)力學(xué)分析

2.1.1 35 ℃下大腸桿菌存活對(duì)數(shù)與處理時(shí)間的關(guān)系

在35 ℃下采用不同壓力進(jìn)行處理，大腸桿菌的存活對(duì)數(shù)隨著保壓時(shí)間的延長而降低（圖1）。不同壓力下的殺菌過程均分為兩個(gè)階段，第1 階段的滅菌速率大于第2 個(gè)階段。在溫度相同的條件下，壓力從10 MPa 升至35 MPa，第1 階段滅菌速率由0.214 6 min-1增加至 0.394 7 min-1，D值從 10.7 min 減少至 5.83 min（表1）；第2 個(gè)階段的滅菌速率則由0.079 8 min-1增加至 0.108 min-1，D值從 28.9 min 減少至 21.32 min，壓力增大大腸桿菌死亡速率也增大。在35 ℃，35 MPa超臨界CO2可降低哈密瓜汁中的大腸桿菌5.74 個(gè)數(shù)量級(jí)。

2.1.2 45 ℃下大腸桿菌存活對(duì)數(shù)與處理時(shí)間的關(guān)系

在45 ℃下，壓力從10 MPa 上升到35 MPa，大腸桿菌的存活數(shù)量級(jí)顯著降低（圖2）。10 MPa 兩個(gè)殺菌階段的R2分別為0.992 9 和0.971 1，第1 個(gè)殺菌過程的滅菌速率（0.305 8 min-1）比第2 個(gè)過程的殺菌速率（0.092 2 min-1）大的多（表 2）。20 MPa 兩個(gè)殺菌階段的R2分別為0.993 2 和0.989 5，線性擬合程度非常好。第1 個(gè)殺菌過程的死亡速率（0.360 2 min-1）也明顯高于第2 個(gè)過程的死亡速率（0.132 min-1）。35 MPa壓力下的滅菌規(guī)律基本相似。壓力從10 MPa 升至20 MPa，第1 階段滅菌速率由0.305 8 min-1增加至0.360 2 min-1，D值也從 7.53 min 減少至 6.39 min；第2個(gè)過程的滅菌速率則由0.0922min-1增加至0.132min-1，D值從24.97 min 減少至17.45 min。表明第1 階段增加壓力死亡速率增加緩慢，而殺菌第2 階段壓力增加時(shí)死亡速率增加較快。壓力由20 MPa 上升到35 MPa，兩個(gè)階段的死亡速率分別增至0.392 4 min-1和 0.171 4 min-1，D值減少至 5.86 min 和 13.44 min。在45 ℃下，35 MPa 超臨界二氧化碳處理后可降低哈密瓜汁中大腸桿菌7.22 個(gè)數(shù)量級(jí)。

表1 35 ℃下超臨界CO2 對(duì)大腸桿菌的滅菌動(dòng)力學(xué)方程與參數(shù)Table 1 Inactivation kinetics equation and parameters of E.coli by SCCO2 at 35 ℃

表2 45 ℃下超臨界CO2 對(duì)大腸桿菌的滅菌動(dòng)力學(xué)方程與參數(shù)Table 2 Inactivation kinetics equation and parameters of E.coli by SCCO2 at 45 ℃

2.1.3 55 ℃下大腸桿菌存活對(duì)數(shù)與處理時(shí)間的關(guān)系

由圖3 可以看出，在55 ℃下，壓力從10 MPa 上升到35MPa，兩個(gè)殺菌階段的大腸桿菌的存活數(shù)量級(jí)均顯著降低（P＜0.05）。不同壓力下第1 階段的滅菌速率均顯著大于第2 階段，而第2 殺菌階段的D值均大于第1 階段（表3）。從10 MPa 增至35 MPa，第1殺菌階段的死亡速率由0.351 9 min-1分別增至0.399 3 min-1和 0.441 7 min-1，D值由 6.54 min 依次減小到5.77 min 和5.21 min，第2 殺菌階段的死亡速率由 0.094 9 min-1增至 0.153 6 min-1和 0.207 7 min-1，D值由24.27 min 依次減小到14.99 min 和11.09 min。

表3 55 ℃下超臨界CO2 對(duì)大腸桿菌的滅菌動(dòng)力學(xué)方程與參數(shù)Table 3 Inactivation kinetics equation and parameters of E.coli by SCCO2 at 55 ℃

2.2 溫度和壓力對(duì)超臨界二氧化碳?xì)⒕Ч挠绊?/h3>

由圖4、5 可以看出，隨著溫度和壓力的升高大腸桿菌死亡速率也在上升。kt反應(yīng)了大腸桿菌對(duì)溫度的敏感程度，kt越大，大腸桿菌對(duì)超臨界處理的溫度越敏感。kp反應(yīng)了大腸桿菌對(duì)壓力的敏感程度，kp越大，大腸桿菌對(duì)超臨界處理的壓力越敏感。滅菌速率kt、kp與溫度、壓力均有良好的線性關(guān)系，說明溫度、壓力越高大腸桿菌敏感度越強(qiáng)。

2.3 超臨界處理大腸桿菌的超微結(jié)構(gòu)的變化

由圖8 可看出，未處理的大腸桿菌外殼光滑，電鏡下電子密度較均勻。超臨界CO2處理大腸桿菌后，細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)被分成小塊，電鏡下的大腸桿菌出現(xiàn)大量的透電子區(qū)，細(xì)胞壁有破裂現(xiàn)象。這可能是因?yàn)镃O2分子在高壓下，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，擾亂了細(xì)胞的新陳代謝，破壞了一些關(guān)鍵酶的活性，也可能因?yàn)槌R界二氧化碳作為介質(zhì)滲透到細(xì)胞內(nèi)部，很快達(dá)到細(xì)胞內(nèi)外的壓力平衡，然后突然降壓導(dǎo)致胞內(nèi)外壓差急劇變化，細(xì)胞劇烈膨脹而發(fā)生破裂，從而達(dá)到破壁的效果[12]，使得細(xì)胞死亡。35 MPa 下大腸桿菌細(xì)胞有明顯的胞漿泄漏現(xiàn)象，部分細(xì)胞壁消失。

3 結(jié)論

（1）超臨界 CO2在壓力 10～35 MPa、溫度 35～55 ℃、時(shí)間10～70 min 的條件下處理哈密瓜汁中大腸桿菌，其滅活過程包括由快到慢兩個(gè)殺菌階段，兩個(gè)階段均符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。

（2）在 35～55 ℃、10～35 MPa 條件下進(jìn)行超臨界二氧化碳處理，隨溫度和壓力的提高，大腸桿菌的滅菌速率逐步上升。

（3）經(jīng)過超臨界CO2處理的大腸桿菌，細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)被分成小塊，細(xì)胞出現(xiàn)缺陷，透電子區(qū)分布不均勻。35 MPa 下超臨界CO2處理的大腸桿菌，有明顯的胞漿泄漏現(xiàn)象，結(jié)構(gòu)層次感完全消失，部分細(xì)胞壁消失。