清旨寧膠囊中沙棘成分薄層色譜鑒別方法

鄧辰辰，許明君，相繼芬, ，王婧，丁艷，柏偉榮

1. 江蘇康緣藥業股份有限公司（連云港 222047）；2. 中藥提取精制新技術重點研究室（連云港 222047）

清旨寧膠囊是一種主要以沙棘、肉蓯蓉、丹參、紅曲等為原料制成的保健食品，具有降血脂的功效。主要制劑工藝為：將沙棘、肉蓯蓉、丹參按配方比例稱其質量，加入適量水，煎煮合并濾液，濃縮，噴霧干燥，制粒，加入紅曲總混，添加輔料后灌裝成膠囊或壓片包衣。為了保證制劑的品質，建立品質標準，現對其中的主要成分沙棘進行薄層色譜鑒別。

薄層層析技術是發展較早的色譜方法之一，其基本原理是利用混合物各組分在某一物質中的吸附或者分配等性能的不同，使樣品溶液中各種物質進行反復的吸附或者分配等作用，從而將各種組分分開。研究[1-5]中，對沙棘成分的TLC鑒別均參考藥典[6]方法，鑒別其中的黃酮類成分。藥典方法前處理復雜，需自制含3%醋酸鈉的硅膠G板且存在陰性干擾。研究建立的鑒別方法快速、簡便、重復性好，為含有沙棘、肉蓯蓉、丹參、紅曲等成分的產品研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

1.1.1 儀器與設備

ZF-20D型暗箱三用紫外分析儀（上海越眾儀器設備有限公司）；KQ-250DB型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；BSA 224S-CW型電子分析天平（德國賽多利斯公司）；BP 211D型電子分析天平（德國賽多利斯公司）；HPD 260型恒溫恒濕箱（德國美墨爾特有限公司）；DHG-9145A型熱風循環烘箱（上海一恒科學儀器有限公司）；HWS26型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司）。

1.1.2 對照藥材與對照品

沙棘對照藥材（批號121519-200501，中國藥品生物制品檢定所）；異鼠李素對照品（純度99.9%，批號110860-201410，中國食品藥品檢定研究院）；槲皮素對照品（純度99.1%，批號100081-201610，中國食品藥品檢定研究院）；齊墩果酸對照品（純度91.7%，批號110709-201607，中國食品藥品檢定研究院）。

1.2 試劑與材料

硅膠G薄層層析板（青島海洋化工有限公司、青島勝海精細硅膠化工有限公司、安徽良臣硅源材料有限公司、青島裕民源硅膠試劑廠）；薄層層析硅膠G（青島海洋化工有限公司）；其余試劑為分析純（南京化學試劑股份有限公司）。

1.3 試驗樣品

清旨寧膠囊（批號20171201、20171202、20171203）共3批次，為江蘇康緣現代中藥研究院研制。

2 方法與結果

2.1 參照藥典方法鑒別沙棘

2.1.1 對照品溶液制備

取異鼠李素和槲皮素對照品，加甲醇制成濃度1 mg/mL的混合對照品溶液。

2.1.2 對照藥材溶液制備

精確稱取0.5 g沙棘對照藥材粉末，置于具塞錐形瓶中，加入50 mL 95%乙醇，稱其質量，加熱回流提取1 h后，冷卻至室溫，稱其質量，用95%乙醇補足損失的質量，搖勻后過濾。吸取25 mL續濾液，置具塞錐形瓶中，加入3.5 mL鹽酸，于75 ℃水浴中加熱水解1 h，立刻冷卻，轉移至50 mL容量瓶中，用95%乙醇少量多次洗滌錐形瓶，洗液并入同一容量瓶中，定容，搖勻后過濾。吸取30 mL續濾液，濃縮至約5 mL，加25 mL水，于分液漏斗中用乙酸乙酯提取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，加入1 mL甲醇溶解殘渣，作為對照藥材溶液[6]。

2.1.3 供試品溶液制備

取2 g膠囊內容物粉末，按照上述對照藥材處理方法，制備供試品溶液。

2.1.4 陰性樣品溶液制備

取除沙棘以外的其他處方藥味，按處方比例及制劑工藝制備陰性制劑，按供試品溶液制備方法，制備陰性樣品溶液。

2.1.5 薄層色譜鑒別

吸取對照品溶液、對照藥材溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液各2 μL，分別點于同一含3%醋酸鈉溶液制備的硅膠G薄層板（自制）上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5∶2∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以三氯化鋁試液，置紫外光燈（365 nm）下檢視[6]。結果見圖1。

圖1 藥典方法沙棘TLC圖

由圖1可以看出，陰性有干擾，藥典方法不適合該產品中沙棘的TLC鑒別。取四味原料藥材分別按制劑工藝制備單味藥材制劑，按上述方法進行鑒別，結果見圖2。

從圖2可以看出，各單味藥材制劑與對照品溶液相同位置處均有熒光斑點。分析結果，應該是其他藥材中的黃酮類成分大部分以異鼠李素、槲皮素、山柰酚為母核，含氧雜環化合物與三氯化鋁試液反應顯色，從而干擾沙棘的鑒別，導致假陽性。

圖2 單味藥材制劑TLC圖

2.2 自建方法鑒別沙棘

2.2.1 對照品溶液制備

取齊墩果酸對照品，用甲醇溶解，制成1 mg/mL的溶液，作為對照品溶液。

2.2.2 對照藥材溶液制備

稱取0.5 g沙棘對照藥材粉末約，加入20 mL三氯甲烷，超聲處理30 min，過濾后蒸干，加1 mL甲醇溶解殘渣，離心后取上清液作為對照藥材溶液。

2.2.3 供試品溶液制備

取2 g膠囊內容物粉末，對照藥材處理方法，制備供試品溶液。

2.2.4 陰性樣品溶液制備

取除沙棘以外的其他處方藥味，按處方比例和制劑工藝制備陰性制劑，按供試品溶液制備方法，制備陰性樣品溶液。

2.2.5 薄層色譜鑒別

吸取對照品溶液、對照藥材溶液、陰性樣品溶液各4 μL，供試品溶液各1，2和4 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-甲酸（40∶1∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在110 ℃加熱至斑點顯色清晰。結果見圖3。

供試品色譜中，在與對照品和對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。色譜斑點清晰可見，Rf值合適，分離度較好，無陰性干擾。樣品和對照品的點樣量在4 μL時分離效果好，斑點清晰。故采用該方法進行沙棘薄層鑒別方法學考察，專屬性較好。

2.3 耐用性考察

2.3.1 展開劑考察

考察3種展開系統：A，三氯甲烷-甲醇-甲酸（40∶1∶1）；B，二氯甲烷-甲醇-甲酸（40∶1∶1）；C，三氯甲烷-乙醇-甲酸（40∶1∶1）；點樣量4 μL。結果見圖4。

可以看出，選擇展開系統A時，斑點清晰可見，分離度較好，故確定三氯甲烷-甲醇-甲酸（40∶1∶1）為TLC鑒別條件。

圖3 自建方法沙棘TLC圖

圖4 沙棘TLC展開系統考察

2.3.2 不同薄層板考察

選擇不同廠家薄層板（青島海洋化工有限公司、安徽良臣硅源材料有限公司、青島裕民源硅膠試劑廠），點樣量4 μL，按照2.1.5的方法展開，顯色。結果見圖5。3種硅膠G板都可以達到較好分離效果，且斑點清晰。說明方法對不同廠家薄層板耐用性較好。

圖5 沙棘TLC薄層板考察

2.3.3 溫度的考察

采用同一廠家的薄層板（青島海洋化工廠分廠），考察不同溫度（低溫4 ℃和室溫20 ℃）條件對薄層鑒別的影響，結果見圖6。

可以看出，在不同溫度4 ℃和20 ℃下，對照品溶液與供試品溶液薄層色譜圖斑點無明顯拖尾現象，分離度較好，但溫度過低時供試品斑點較模糊。相比較而言，20 ℃時分離效果較好，說明薄層鑒別方法的溫度耐用性良好。

圖6 沙棘薄層鑒別溫度考察

2.3.4 濕度的考察

采用同一廠家的薄層板（青島海洋化工廠分廠），在一小房間中用除濕機和加濕器控制環境濕度，考察不同濕度（40%，60%和80%）條件對薄層鑒別的影響，結果見圖7。

從圖7可知，在3種不同相對濕度（40%，60%和80%）的條件下展開，對照品、對照藥材溶液和供試品溶液的TLC斑點均能實現分離，分離度較好；但相對濕度過高時，斑點拖尾較明顯，說明薄層鑒別方法的濕度耐用性良好。

圖7 沙棘薄層鑒別濕度考察

2.4 3批次制劑中沙棘TLC鑒別

圖8 3批次制劑中沙棘薄層鑒別驗證

取3批次制劑成品，研細混勻，分別取2 g粉末，加20 mL三氯甲烷，超聲處理30 min，過濾后蒸干，加1 mL甲醇溶解殘渣，離心后取上清液作為供試品溶液。吸取對照品溶液、對照藥材溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液各4 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-甲酸（40∶1∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在110℃加熱至斑點顯色清晰，結果見圖8。結果顯示，供試品溶液薄層色譜圖中，在與對照品和對照藥材溶液薄層色譜的相應位置上，顯示相同顏色的斑點，Rf值合適，分離度較好。

3 討論

采用藥典方法對該制劑中的沙棘進行TLC鑒別時，前處理方法復雜，需要自制3%醋酸鈉硅膠G板，且陰性有干擾，主要是其他各味藥材中的含氧雜環化合物導致假陽性。查閱文獻[7-12]后，選擇齊墩果酸作為配方中沙棘特有的標志性成分，采用自建方法進行TLC鑒別。

在供試品溶液的制備中，考察不同溶劑（乙酸乙酯、三氯甲烷、95%乙醇）超聲提取方法，結果發現三氯甲烷超聲提取法對沙棘中熊果酸提取效率最高，分離度好且無陰性干擾，可直接進行點樣，避免復雜的前處理步驟。

展開系統的選擇上，比較3種展開系統，確定三氯甲烷-甲醇-甲酸（40∶1∶1）為展開條件時，色譜斑點清晰、分離度好。系統耐用性試驗表明，該自建方法對溫度、濕度、不同廠家薄層板的耐用性較好。

4 結論

薄層色譜法是中藥復方制劑定性鑒別的主要方法，具有專屬性強、簡便易操作等特點。試驗利用齊墩果酸對清旨寧復方制劑中的沙棘進行薄層色譜的研究和分析，所建立的TLC鑒別方法快速、準確、可靠、耐用性強，可對清旨寧復方制劑進行科學的品質控制，為同樣含有類似原料成分的產品品質標準研究提供參考。

后續研究可以考察并確定按藥典方法鑒別時產生干擾的黃酮類成分的分子結構。