量子點(diǎn)標(biāo)記熒光免疫法檢測(cè)過(guò)氧化氫酶

李夢(mèng)瑤 ，王書(shū)雅，謝云峰，張修珂，劉云國(guó)，翟晨*

1. 新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院（烏魯木齊 830002）；2. 中糧營(yíng)養(yǎng)健康研究院，營(yíng)養(yǎng)健康與食品安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（北京 102209）；3. 臨沂大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院（臨沂 276000）

過(guò)氧化氫酶（CAT），是生物體系的關(guān)鍵防御酶之一[1]。由CAT構(gòu)成的酶保護(hù)系統(tǒng)可以消除植物細(xì)胞呼吸代謝產(chǎn)生的有害物質(zhì)，具有使植物免受氧化脅迫、提高植物抗逆水平和光合效率、增強(qiáng)植物防御能力、延緩衰老等作用[2-4]。果蔬采摘后，其后熟到劣變過(guò)程本質(zhì)是細(xì)胞呼吸代謝產(chǎn)物引起的氧化現(xiàn)象的發(fā)生。因此，CAT含量的變化是評(píng)判番茄等農(nóng)副產(chǎn)品新鮮度的一個(gè)重要指標(biāo)。CAT含量的檢測(cè)多采用凝膠電泳法、免疫印跡法和考馬斯亮藍(lán)染色法等[5-7]。這些方法受主觀因素影響較大，且操作繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不是一種理想的檢測(cè)方法。因此亟需開(kāi)發(fā)一種準(zhǔn)確、靈敏的檢測(cè)方法。

量子點(diǎn)（QDs）直徑介于1～10 nm，是一種受激發(fā)后可產(chǎn)生熒光的微納米材料[8]。作為一種新型熒光標(biāo)記探針，具有高靈敏度、高熒光效率、獨(dú)特的光學(xué)性能、生物兼容性好等多種優(yōu)點(diǎn)[9,11]。基于量子點(diǎn)熒光標(biāo)記免疫分析技術(shù)在微生物檢測(cè)、農(nóng)獸藥殘留、蛋白類(lèi)毒素、重金屬殘留等方面得到廣泛應(yīng)用，但對(duì)于蛋白酶類(lèi)的分析檢測(cè)研究較少[10-15]。因此，試驗(yàn)利用量子點(diǎn)標(biāo)記過(guò)氧化氫酶合成量子點(diǎn)-過(guò)氧化氫酶（QDs-CAT）熒光探針，建立過(guò)氧化氫酶免疫熒光分析檢測(cè)的新方法，并對(duì)探針合成條件和檢測(cè)條件進(jìn)行優(yōu)化，使得該方法具有較寬檢測(cè)范圍、低檢測(cè)限和高靈敏度，通過(guò)番茄樣品加標(biāo)回收驗(yàn)證量子點(diǎn)標(biāo)記熒光免疫法檢測(cè)過(guò)氧化氫酶可行性。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

F-7000型熒光分光光度計(jì)（日本Hitachi公司）；高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；恒溫培養(yǎng)搖床（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；Synergy Mx熒光酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Tek公司）。

量子點(diǎn)（CdSe/ZnS，上海昆道生物科技有限公司）；過(guò)氧化氫酶、過(guò)氧化氫酶抗體（上海士峰生物科技有限公司）；1-乙基-（3-二甲氨基丙基）-碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；黑色96孔板（美國(guó)Corning公司）。

試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 量子點(diǎn)熒光探針制備

量取100 μL 1 mg/mL量子點(diǎn)至700 μL 25 mmol/L pH 6.0 PBS 緩沖液中，加入100 μL 3 mg/mL NHS和100 μL 2 mg/mL EDC溶液，超聲分散均勻，置于30 ℃250 r/min恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)30 min，于8 000 r/min的離心機(jī)中常溫離心10 min，去掉上清液[16]。加入1 mL 100 μg/mL CAT抗原溶液復(fù)溶，超聲分散均勻，置于37 ℃ 250 r/min恒溫培養(yǎng)箱中避光反應(yīng)1.5 h；反應(yīng)結(jié)束后在10 000 r/min下離心10 min，去除上清液中游離的過(guò)氧化氫酶。加入1 mL pH 7.4的PBST溶液，超聲分散均勻，在250 r/min，37 ℃搖床振蕩1 h，取出，4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 熒光免疫檢測(cè)方法的建立

用pH 7.4、0.01 mol/L PBS緩沖液對(duì)過(guò)氧化氫酶抗體進(jìn)行稀釋?zhuān)悦靠?00 μL加入酶標(biāo)板中，4 ℃下包被過(guò)夜后，用含0.5%吐溫-20的0.01 mol/L pH 7.4的PBS洗滌3次并甩干，每孔加入250 μL的1% BSA，在37 ℃下對(duì)所述空白位點(diǎn)進(jìn)行封閉1.5 h。洗板3次，每孔分別加入50 μL不同濃度的過(guò)氧化氫酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液（樣品液）和50 μL QDs-CAT探針溶液（PBS 稀釋?zhuān)?7 ℃下與包被在所述酶標(biāo)板中的過(guò)氧化氫酶多克隆抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合1 h[17]。洗滌3次并甩干，每孔加入100 μL PBS緩沖液，用熒光酶標(biāo)儀激發(fā)并檢測(cè)所形成的抗體-抗原發(fā)光免疫復(fù)合物的熒光強(qiáng)度，其中激發(fā)波長(zhǎng)375 nm，檢測(cè)波長(zhǎng)622 nm。以一系列不同濃度的過(guò)氧化氫酶標(biāo)準(zhǔn)溶液中的過(guò)氧化氫酶的濃度為橫坐標(biāo)，所獲得的熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 方法學(xué)評(píng)價(jià)與應(yīng)用

1.3.1 特異性試驗(yàn)

果蔬等樣品的粗提液基質(zhì)較為復(fù)雜，為了研究在最佳條件下其他物質(zhì)是否會(huì)干擾酶的檢測(cè)。試驗(yàn)在相同條件下，對(duì)樣本中可能存在的干擾物質(zhì)，如離子（NaCl、KCl、CaCl2）、維生素C、葡萄糖、氨基酸（絲氨酸、蘇氨酸）進(jìn)行探究。

1.3.2 番茄樣品加標(biāo)回收和準(zhǔn)確度試驗(yàn)

取新鮮的番茄，洗凈晾干，于攪拌機(jī)中打碎10 min，冰浴狀態(tài)下用研缽研磨至泥狀。按料液比1∶2（g/g）稱(chēng)取一定量番茄泥，加入樣品提取液（0.05 mol/L PBS緩沖液）在4 ℃高速離心機(jī)中以5 000 r/min進(jìn)行離心30 min，取上清液作為樣本溶液。進(jìn)行超高溫加熱處理，致使樣溶液中的過(guò)氧化氫酶失活，待其冷卻至室溫。添加過(guò)氧化氫酶標(biāo)準(zhǔn)品于樣本溶液中，采用建立的方法對(duì)樣本溶液進(jìn)行分析。每份樣本進(jìn)行5次平行試驗(yàn)，并且連續(xù)3 d重復(fù)試驗(yàn)，計(jì)算每個(gè)樣本的回收率以及批內(nèi)、批間的變異系數(shù)[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 量子點(diǎn)-過(guò)氧化氫酶表征分析

由于量子點(diǎn)表面含有羧基官能團(tuán)，其在活化劑NHS/EDC作用下，可與含有氨基的過(guò)氧化氫酶反應(yīng)生成穩(wěn)定的酰胺鍵。通過(guò)對(duì)偶聯(lián)前后量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度進(jìn)行比較（圖1），發(fā)現(xiàn)偶聯(lián)前后的發(fā)射波長(zhǎng)的峰位置沒(méi)有明顯紅移現(xiàn)象，且偶聯(lián)過(guò)程對(duì)量子點(diǎn)的熒光信號(hào)影響較小[16]。因此QDs-CAT熒光探針可用于免疫檢測(cè)。

2.2 參數(shù)優(yōu)化

2.2.1 NHS/EDC添加量的確定

NHS/EDC的添加量會(huì)影響量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度和量子點(diǎn)與過(guò)氧化氫酶的偶聯(lián)率。因此，保持其他試驗(yàn)條件不變情況下，改變NHS/EDC添加量，對(duì)合成QDs-CAT熒光探針按照1.2方法進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)。結(jié)果表明（圖2 A）NHS/EDC的添加量10 μL時(shí)，即NHS/EDC的濃度分別為3和2 μg/mL，熒光強(qiáng)度較高，表明偶聯(lián)效果好且對(duì)量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度影響較小。

2.2.2 pH

體系的pH會(huì)影響過(guò)氧化氫酶的活性和量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度。在不同pH條件下，量子點(diǎn)與過(guò)氧化氫酶進(jìn)行偶聯(lián)合成反應(yīng)，并對(duì)合成物進(jìn)行免疫熒光分析。結(jié)果表明（圖2 B）在pH 7.4時(shí)，過(guò)氧化氫酶與抗體存在較好的特異性結(jié)合且熒光信號(hào)相對(duì)較高。因此，選擇pH 7.4的磷酸鹽緩沖液作為偶聯(lián)反應(yīng)的緩沖液。

2.2.3 抗體添加量

保持其他試驗(yàn)條件不變情況下，優(yōu)化抗體添加量。結(jié)果如圖2C所示，熒光信號(hào)值隨著抗體濃度增加而增強(qiáng)，抗體濃度1 μg/mL時(shí)，熒光信號(hào)值達(dá)到最大；隨著抗體濃度繼續(xù)增加，熒光信號(hào)值降低。原因可能是空間位阻使得抗體與酶標(biāo)板結(jié)合的穩(wěn)定性降低，在洗脫過(guò)程中大部分抗體被洗脫，導(dǎo)致抗原抗體量結(jié)合物減少且熒光強(qiáng)度信號(hào)值減低。故初選抗體濃度1 μg/mL。

2.2.4 熒光探針QDs-CAT添加量

由于是采用競(jìng)爭(zhēng)法對(duì)CAT進(jìn)行檢測(cè)，QDs-CAT熒光探針的添加量將直接影響試驗(yàn)結(jié)果。因此，通過(guò)抗體與含有不同濃度QDs-CAT熒光探針?lè)跤M(jìn)行熒光檢測(cè)，確定QDs-CAT最佳添加量。結(jié)果如圖2D所示，熒光信號(hào)值隨著QDs-CAT熒光探針添加量增加而增強(qiáng)，QDs-CAT添加量10 μg/mL時(shí)，熒光信號(hào)達(dá)到最值，繼續(xù)增大QDs-CAT添加量，熒光信號(hào)值的強(qiáng)度基本不變。為了節(jié)約試驗(yàn)成本，選擇10 μg/mL濃度的QDs-CAT進(jìn)行試驗(yàn)研究。

2.2.5 BSA濃度的確定

封閉液能降低非特異性結(jié)合，提高檢測(cè)靈敏度。試驗(yàn)在其他條件不變情況下，以未進(jìn)行封閉處理的作為對(duì)照試驗(yàn)，由圖2E可知，由于非特異性吸附導(dǎo)致熒光信號(hào)值較高；與對(duì)照孔相比，進(jìn)行封閉處理的微孔中的熒光信號(hào)值顯著降低。BSA封閉液的濃度≥1%時(shí)，其熒光信號(hào)值與對(duì)照孔的差異最明顯。考慮到試驗(yàn)成本，因此確定選擇1% BSA作為封閉液。

2.2.6 檢測(cè)時(shí)間選擇

孵育時(shí)間影響抗原抗體復(fù)合物的形成，且對(duì)試驗(yàn)的熒光信號(hào)值有重要的影響。因此，試驗(yàn)在其他條件不變的情況下，對(duì)孵育時(shí)間進(jìn)行考察。由圖2F可知，熒光信號(hào)值隨著孵育時(shí)間增加而增強(qiáng)，在60 min時(shí)，熒光信號(hào)值達(dá)到最大，繼續(xù)延長(zhǎng)孵育時(shí)間，熒光強(qiáng)度變化不大，表明抗原抗體結(jié)合基本達(dá)到穩(wěn)定，因此試驗(yàn)選擇60 min作為抗原抗體孵育時(shí)間。

圖1 量子點(diǎn)偶聯(lián)前后熒光光譜圖

圖2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3 免疫熒光檢測(cè)方法建立

在最佳反應(yīng)條件下（pH 7.4 PBS中37 ℃反應(yīng)60 min），考察探針對(duì)不同濃度的過(guò)氧化氫酶標(biāo)準(zhǔn)溶液（0，0.05，0.1，1，50，100，200，400，600，800和1 000 μg/mL）的熒光光譜信號(hào)的變化，如圖3所示。

圖3 過(guò)氧化氫酶的熒光光譜圖和線性關(guān)系圖

過(guò)氧化氫酶濃度在1～1 000 μg/mL的范圍內(nèi)，探針的熒光光譜信號(hào)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性回歸方程ΔF=0.593 7C+154.3（R2=0.994 2），式中：ΔF是探針在有無(wú)過(guò)氧化氫酶存在的條件下其熒光強(qiáng)度光譜信號(hào)的變化；C為過(guò)氧化氫酶濃度（μg/mL）。其最低檢測(cè)限為2.5×10-2μg/mL。

2.4 特異性試驗(yàn)

試驗(yàn)空白對(duì)照孔熒光強(qiáng)度F0，含有不同種類(lèi)離子（30 μmol/L的KCl、CaCl2、NaCl，15 mmol/L的維生素C（VC）、葡萄糖、絲氨酸、蘇氨酸）和200 μg/mL的蛋白樣本溶液的熒光強(qiáng)度F，以相對(duì)熒光強(qiáng)度ΔF（ΔF=F0-F）考察不同抗原對(duì)免疫檢測(cè)熒光強(qiáng)度的影響[19-20]。如圖4所示，含有CAT試樣的熒光響應(yīng)信號(hào)值較高，其它干擾物質(zhì)的熒光強(qiáng)度都低于50，表明該方法有較好的選擇專(zhuān)一性。

圖4 干擾物的熒光響應(yīng)信號(hào)圖

2.5 樣品加標(biāo)回收和準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)中對(duì)不同批次的番茄提取液進(jìn)行了加標(biāo)回收。采用所建立的方法進(jìn)行檢測(cè)，試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。應(yīng)用該方法檢測(cè)得到的回收率＞90%，且批內(nèi)、批間變異系數(shù)均＜15%，說(shuō)明建立的方法準(zhǔn)確度好，可應(yīng)用于實(shí)際樣品中CAT的檢測(cè)。

表1 番茄中過(guò)氧化氫酶的添加回收率和變異系數(shù)

3 討論

試驗(yàn)建立一種過(guò)氧化氫酶量子點(diǎn)熒光免疫檢測(cè)方法。試驗(yàn)以熒光強(qiáng)度為指標(biāo)，對(duì)熒光探針合成條件和免疫熒光分析檢測(cè)條件等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。在最佳條件下建立過(guò)氧化氫酶檢測(cè)模型，方法線性范圍為1～1 000 μg/mL，相關(guān)系數(shù)為0.994 2，最低檢測(cè)限可達(dá)2.5×10-2μg/mL，并對(duì)番茄樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，結(jié)果表明該方法回收率高，且具有較好的穩(wěn)定性和特異性。可以初步實(shí)現(xiàn)對(duì)過(guò)氧化氫酶的定量，為實(shí)際檢測(cè)節(jié)省大量時(shí)間，適用于大樣本快速檢測(cè)，具有良好的應(yīng)用前景。

量子點(diǎn)因其獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)，以及與蛋白質(zhì)偶聯(lián)技術(shù)日趨成熟，其在免疫分析中的應(yīng)用也愈加廣泛。量子點(diǎn)免疫熒光法與傳統(tǒng)的ELISA和熒光方法相比，具有分析時(shí)間短、檢測(cè)限低、步驟簡(jiǎn)單、可直觀檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)該方法也為用于其他蛋白酶類(lèi)的定量熒光免疫檢測(cè)提供參考。

4 結(jié)論

試驗(yàn)基于量子點(diǎn)熒光探針，結(jié)合免疫熒光法，建立了番茄中過(guò)氧化氫酶的熒光檢測(cè)技術(shù)。通過(guò)對(duì)試驗(yàn)中的各種影響因素、探針的特異性、樣品加標(biāo)回收、批內(nèi)和批間變異系數(shù)等指標(biāo)進(jìn)行探討，證實(shí)了該方法操作簡(jiǎn)單、線性范圍寬、回收率高、變異系數(shù)＜15%，且具有較好的特異性和準(zhǔn)確度，為過(guò)氧化氫酶含量檢測(cè)提供了一種新方法。