ε-聚賴氨酸對冷鮮肉理化特性的影響

馮建嶺，李迎秋

1. 威海市食品藥品檢驗檢測中心（威海 264210）；2. 齊魯工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院（濟南 250353）

一般來說，肉及肉類產(chǎn)品水分活度高、蛋白占比高并且富含相對大量的自由氨基酸，因此比較容易被微生物污染[1]。用于評價肉及肉類產(chǎn)品腐敗變質(zhì)的指標中，微生物特性和理化指標比較常見，如菌落總數(shù)（TBC）、pH、揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）含量、高鐵肌紅蛋白（MetMb）含量和硫代巴比妥酸（TBA）值。Souza等[2]就通過測定TBC、pH、TVB-N含量及TBA值，對一些添加劑延長三文魚保質(zhì)期進行系統(tǒng)研究。Duan等[3]利用監(jiān)測鱈魚pH、TBA值及TBC的變化，來評價魚油和殼聚糖復(fù)配制成涂層改善鱈魚片的微生物及一些理化特性。另外，Rodríguez-Carpena等[4]分析生豬肉餅中MetMb含量及TBA值的變化，結(jié)果表明，鱷梨的副產(chǎn)品可作為一種優(yōu)良的抑制劑，能減緩肉餅顏色的惡化、抑制脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的氧化。

關(guān)于ε-PL對冷鮮肉理化特性影響的研究較少。因此，試驗通過觀察經(jīng)ε-PL處理后冷鮮肉理化特性（TBC、pH、TVB-N含量、MetMb含量及TBA值）的變化，分析天然防腐劑ε-PL對冷鮮肉的保鮮效果。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

冷鮮肉（市售）；ε-聚賴氨酸（ε-PL，浙江新銀象生物有限公司）；胰蛋白胨、酵母浸膏、葡萄糖、瓊脂粉均為生化試劑，氫氧化鈉、硼酸、乙醇、氧化鎂、二水磷酸二氫鈉、十二水磷酸氫二鈉、氯化鈉、冰醋酸（均為分析純，北京索萊寶科技有限公司）；甲基紅、次甲基藍、α-硫代巴比妥酸（天津市大茂化學(xué)試劑廠）。

1.2 試驗設(shè)備

透明門立式冷藏柜（SC-329，青島海爾股份有限公司）；絞肉機（JYS-A800，九陽器械有限公司）；雙人雙面凈化工作臺（SW-CJ-2F，蘇州凈化設(shè)備有限公司）；生化恒溫培養(yǎng)箱（SHP-150，上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；酸度計（PB-10，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；恒溫攪拌器（JB-2A，上海雷磁創(chuàng)益儀器儀表有限公司）；雙光束紫外可見分光光度計（TU-1901，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；高速離心機（TG16-WS，長沙湘智離心機儀器有限公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（DK-98-ⅡA，金壇市金南儀器廠）；立式電熱壓力蒸汽滅菌器（LDZX-50KB，上海申安醫(yī)療器械廠）。

1.3 試驗方法

1.3.1 試劑的配制

ε-PL溶液：準確稱取ε-PL粉末，用蒸餾水分別稀釋至0.50，0.75，1.00，1.25和1.50 g/100 mL，經(jīng)高溫高壓滅菌后備用。

平板計數(shù)培養(yǎng)基：稱取5 g胰蛋白胨、15 g瓊脂粉、10 g葡萄糖及2.5 g酵母浸膏，加蒸餾水至1 000 mL，再用氫氧化鈉溶液（2 mol/L）調(diào)pH至7.0～7.2，在121 ℃、0.1 MPa條件滅菌22 min。

吸收液：稱取20 g硼酸，加無菌水至1 L，使其充分溶解。

混合指示劑：甲基紅-乙醇（2 g/L）與次甲基藍（1 g/L）指示劑等量充分混合。

氧化鎂懸液：稱取10 g氧化鎂，加無菌水至1 L。

磷酸緩沖液：稱取0.4 g二水磷酸二氫鈉、6 g十二水磷酸氫二鈉、9 g氯化鈉，加800 mL蒸餾水?dāng)嚢杈鶆颍{(diào)pH至7.0，定容至1 L，經(jīng)高溫高壓滅菌后放冷藏柜中保存。

TBA試劑：將2.883 gα-硫代巴比妥酸溶解在100 mL冰醋酸（95%）中，同時用沸水浴助溶。

1.3.2ε-PL溶液對冷鮮肉的預(yù)處理

用無菌刀具將冷鮮肉切成小塊（1 cm×1 cm×1 cm），平分為6份（每份約170 g）。這6份樣品分別浸泡在0，0.50，0.75，1.25和1.50 g/100 mL的ε-PL溶液中30 s，用無菌不銹鋼網(wǎng)篩抽濾1 min。裝入無菌塑料袋置于4 ℃冷藏柜中，備用。測定有關(guān)指標之前，先用絞肉機將冷鮮肉絞成糜狀。

1.3.3 冷鮮肉的微生物分析

在第0，第1，第2，第3，第4，第6，第7和第8天，分別從每組樣品中取出5g冷鮮肉，與25 mL無菌磷酸緩沖液在9 000 r/min條件下均質(zhì)2 min。把勻漿連續(xù)梯度稀釋，取出0.1 mL均勻涂在含有平板計數(shù)培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，倒置于生化培養(yǎng)箱（37 ℃）中培養(yǎng)48 h，分別進行菌落總數(shù)計數(shù)，數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成對數(shù)形式。試驗重復(fù)3次，取平均值。

1.3.4 冷鮮肉中pH的測定

對Souza等[2]和Duan等[3]的方法進行改進，用于冷鮮肉pH的測定，在第0，第1，第2，第3，第4，第6，第7和第8天時，從各組樣品中分別取5 g冷鮮肉放入100 mL燒杯中，在攪拌機作用下與50 mL無菌水混勻。混合液經(jīng)定性濾紙過濾后，用精密酸度計分別測定各組濾液的pH。做3組平行試驗，得平均值。

1.3.5 冷鮮肉中TVB-N的測定

參照Goulas等[5]的研究，對冷鮮肉的TVB-N值進行測定。利用電磁攪拌器，在貯藏期第0，第1，第2，第3，第4，第6，第7和第8天時，分別從各組取5 g冷鮮肉與50 mL無菌水混勻30 min。混合液經(jīng)濾紙過濾后，濾液暫置于4 ℃冷藏柜中。將5 mL硼酸吸收液和4滴混合指示劑混合均勻，倒入錐形瓶中，放在蒸餾裝置冷凝器的底部。分別將2 mL各組備用濾液與等體積的氧化鎂懸液（10 g/L）均勻混合，將混合液放入蒸餾器的反應(yīng)室中蒸餾5 min，同時，將蒸餾液滴入先前的錐形瓶（包括吸收液和混合指示劑）中。用鹽酸標準溶液（0.01 mol/L）滴定錐形瓶中混合液至藍紫色，并記錄鹽酸溶液的體積。同時做空白對照，各組樣品的TVB-N值按式（1）進行計算。

式中：V1為滴定樣品所消耗鹽酸標準溶液體積，mL；c為鹽酸溶液濃度，mol/L；V2為空白組所消耗鹽酸標準溶液體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g。

1.3.6 冷鮮肉中MetMb含量的測定

采用改進Maqsood等[6]的方法，測定高鐵肌紅蛋白含量。在貯藏期第0，第1，第2，第3，第4，第6，第7和第8天，從各組樣品中分別取3 g冷鮮肉與10 mL磷酸緩沖液（pH 7.0）充分混勻，室溫反應(yīng)30 min，在6 000 r/min條件下離心15 min，得上層清液。利用紫外可見分光光度計，分別在572，565，545和525 nm波長處下測定各組上清液的吸光度（A）。MetMb的計算如式（2）所示。

式中：R1，R2，R3分別為A572nm/A525nm，A565nm/A525nm，A545 nm/A525 nm。

1.3.7 冷鮮肉中TBA值的測定

參照Rodríguez-Carpena等[4]的方法，測定冷鮮肉中TBA值。在第0，第1，第2，第3，第4，第6，第7和第8天，從每組樣品中取出10 g冷鮮肉分別浸泡于50 mL無菌水中（5 min），所得懸浮液轉(zhuǎn)移到500 mL的凱氏燒瓶中，逐滴加入4 mol/L的鹽酸溶液調(diào)至pH 1.5上下。選用液體石蠟作為消泡劑，并將幾顆玻璃珠放入燒瓶內(nèi)。啟動蒸餾設(shè)備，開始蒸餾，沸騰10 min之后收集蒸餾液。準確量取5 mL蒸餾液置于25 mL具塞比色管內(nèi)，加入等體積的TBA試劑劇烈振蕩混勻，在沸水浴下反應(yīng)35 min，用5 mL無菌水作對照，測定混合液在532 nm波長下的吸光度（A），按照式（3）對冷鮮肉中的TBA值進行計算。

2 結(jié)果與討論

2.1 ε-PL處理前后冷鮮肉中TBC值的變化

如表1所示，隨著貯藏天數(shù)增加，所有樣品log10CFU/g的值均呈現(xiàn)上升的趨勢。在整個貯藏期間，對照組樣品log10CFU/g的值從3.48增加到10.62，處理組冷鮮肉log10CFU/g的值增長速度比對照組緩慢。此外，隨著ε-PL濃度增加，冷鮮肉的log10CFU/g值逐漸變小。方差分析（如表1所示）表明，1.25 g/100 mL和1.50 g/100 mLε-PL比其他3個濃度（0.50，0.75和1.00 g/100 mL）的ε-PL具有更為顯著的抑菌特性（p＜0.05）。而且，1.25 g/100 mL和1.50 g/100 mLε-PL在降低冷鮮肉的log10CFU/g值方面沒有顯著性差異（p＞0.05）。另外，在貯藏期第6天，經(jīng)1.25 g/100 mL和1.50 g/100 mLε-PL處理的冷鮮肉感官特性易被接受。而在第8天時，所有樣品的log10CFU/g值均超過6.56，并且感官表現(xiàn)為“不可接受的”。結(jié)果表明，1.25 g/100 mL和1.50 g/100 mLε-PL能夠顯著抑制細菌的生長繁殖，使冷鮮肉的貨架期延長至6 d。

2.2 ε-PL處理前后冷鮮肉中pH的變化

在8 d的貯藏期內(nèi)（4 ℃），經(jīng)不同濃度ε-PL處理的冷鮮肉與對照組pH的變化如表2所示。隨著貯藏時間增加，所有冷鮮肉樣品的pH均呈現(xiàn)上升趨勢，而且，ε-PL處理組pH的增長速度要比對照組更緩慢，在整個貯藏期間，對照組的pH始終高于處理組。在第3和第4天，對照組冷鮮肉pH 6.12和6.60，即將腐敗變質(zhì)，0.50 g/100 mLε-PL處理的冷鮮肉pH最高為5.99，仍然為新鮮肉（感官評價）。在貯藏期第6天，隨著ε-PL處理濃度增加，樣品pH逐漸降低，分別為7.00，6.42，6.30，6.00，5.78和5.60。分析結(jié)果顯示，經(jīng)1.25 g/100 mL和1.50 g/100 mLε-PL處理的冷鮮肉pH顯著地降低（p＜0.05），而且這2個濃度ε-PL對冷鮮肉pH的影響沒有明顯差異（p＞0.05）。

據(jù)報道，隨著貯藏時間增加，肉中微生物活動及其代謝產(chǎn)物產(chǎn)生會導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解，產(chǎn)生一些堿性物質(zhì)如氨及有機胺，從而引起pH增加[2,7]。試驗中冷鮮肉pH的增加趨勢與Jay等[8]的發(fā)現(xiàn)較為一致，研究認為pH增加是由于魚肉中細菌的生長繁殖。結(jié)果表明，1.25 g/100 mL和1.50 g/100 mLε-PL能夠抑制細菌的生長繁殖，減弱肉類蛋白的降解作用，延長冷鮮肉的貯藏時間。

表2 ε-PL處理前后冷鮮肉中pH的變化

2.3 ε-PL處理前后冷鮮肉中TVB-N值的變化

通常來說，TVB-N值是衡量冷鮮肉腐敗變質(zhì)的重要指標，TVB-N含量越低，肉就越新鮮[9]。

不同濃度ε-PL對冷鮮肉中TVB-N值的影響如表3所示。冷鮮肉樣品的起始TVB-N值約9.0 mg/100 g，此時冷鮮肉質(zhì)量特性良好。隨著貯藏時間增加，對照組的TVB-N值從9.0 mg/100 g增加到26.5 mg/100 g，處理組冷鮮肉的TVB-N值變化稍微緩慢。在第3天，經(jīng)1.50，1.25和0.50 g/100 mLε-PL處理的樣品TVB-N值分別為9.9，10.4和16.0 mg/100 g，而對照組的TVB-N值達20.3 mg/100 g。第6天時，1.50，1.25，1.00，0.75和0.50 g/100 mLε-PL處理的冷鮮肉TVB-N值分別是14.6，15.8，18.0，20.0和20.9 mg/100 g（表3），而對照組TVB-N值為24.3 mg/100 g。方差分析顯示，相比其他3個濃度（1.00，0.75和0.50 g/100 mL），1.50 g/100 mL和1.25 g/100 mLε-PL能顯著降低冷鮮肉中TVB-N含量（p＜0.05）。結(jié)果說明，1.50 g/100 mL和1.25 g/100 mLε-PL能極其有效地預(yù)防冷鮮肉腐敗變質(zhì)。2.4ε-PL處理前后冷鮮肉中MetMb含量的變化

對消費者來說，色澤是判斷冷鮮肉新鮮程度的一個重要指標[10]。肉的色澤改變正是由于肉中氧合肌紅蛋白、肌紅蛋白及高鐵肌紅蛋白之間的相互轉(zhuǎn)化。而且，冷鮮肉色澤從亮到暗的改變是由高鐵肌紅蛋白含量增加引起的[6,11]。

不同濃度ε-PL處理的冷鮮肉MetMb含量變化如表4所示。起始時，冷鮮肉中MetMb含量大約為8.0%，隨著時間增加，MetMb值逐漸變大。與對照組相比，處理組冷鮮肉的MetMb含量在整個貯藏期間的增長趨勢更為緩慢。在相同貯藏時間內(nèi)，冷鮮肉中MetMb含量隨ε-PL濃度的增加而降低。在第6天時，對照組的MetMb含量（43.3%）是1.25 g/100 mL和1.50 g/100 mLε-PL處理組（20.1%和18.2%）的2倍多。此外，方差分析結(jié)果顯示，1.25 g/100 mL和1.50 g/100 mLε-PL能顯著影響冷鮮肉中MetMb含量（p＜0.05）。在貯藏期第8天，樣品中MetMb含量變化與第6天類似，但感官表現(xiàn)為“不可接受”。結(jié)果說明，1.25 g/100 mL和1.50 g/100 mLε-PL能有效抑制冷鮮肉顏色改變，而且這種有效性依賴于ε-PL濃度的變化。

表3 ε-PL處理前后冷鮮肉中TVB-N值的影響 mg·100 g-1

表4 ε-PL處理前后冷鮮肉中MetMb含量變化 %

2.5 ε-PL處理前后冷鮮肉中TBA值的變化

在肉及肉制品加工過程中，TBA值是評價脂質(zhì)氧化的一個關(guān)鍵性指標。通過測定丙二醛含量，檢測TBA值的變化，數(shù)值增加表明脂質(zhì)氧化變得更加嚴重[2, 12]。

如表5所示，在這8 d的冷藏期間，所有樣品的TBA值都緩慢增加，起始值都低于0.9 mg/kg。用0，0.50，0.75，1.00，1.25和1.50 g/100 mLε-PL處理冷鮮肉在第8天的TBA值分別是1.53，1.56，1.51，1.58，1.40和1.80 mg/kg。統(tǒng)計分析顯示，隨著ε-PL濃度增加，所有樣品的TBA值沒有顯著性的差異（p＞0.05），表明ε-PL對冷鮮肉沒有抗氧化的效果。

表5 ε-PL處理前后冷鮮肉中TBA值的變化 mg·kg-1

3 結(jié)論

結(jié)果表明，與對照組相比，ε-PL作用于冷鮮肉時，隨著ε-PL濃度增加，其對冷鮮肉的菌落總數(shù)、pH、揮發(fā)性鹽基氮及高鐵肌紅蛋白含量等理化特性均產(chǎn)生顯著性影響。然而，ε-PL并不會影響冷鮮肉的硫代巴比妥酸值。試驗結(jié)果表明，1.25 g/100 mL和1.50 g/100 mLε-PL能顯著抑制微生物的生長繁殖，減弱冷鮮肉中蛋白質(zhì)的降解作用，并阻止肉的顏色改變。因此，ε-PL有很好的潛力作為天然食品防腐劑，并能有效延長冷鮮肉的貨架期。