響應面法優化蘆丁的熒光檢測條件

張換平，杜慧，申艷紅，康榮

安陽工學院化學與環境工程學院（安陽 455000）

中藥的黃酮類物質進行提取過程中，蘆丁是經常被用來作為檢測對照品的物質[1]，優化蘆丁的檢測條件對黃酮類物質的測定尤其重要。由于不同的中藥中所含的黃酮類物質種類、含量各不相同，在對黃酮類物質進行檢測時可選用的檢測方式就有所不同，由于蘆丁能與鋁離子結合生成一種具有熒光特性且較穩定的絡合物[2]，對于常用的紫外檢測[3]、熒光檢測[4]、液相色譜檢測[5]等的檢測方式中，熒光檢測就備受青睞，試驗借助熒光分光光度計對蘆丁進行檢測時的溶劑及發生熒光反應時的條件進行優化[6]，為黃酮類物質進行檢測、測量時提供可參考的依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

蘆丁（≥98%，阿拉?。?；蘆丁溶液（質量濃度3.026 mg/mL）；其他試劑均為分析純。

F-7000型分子熒光光度計（日本日立高新技術公司）；FA10048型電子分析天平（上海佑科儀器儀表有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 測定原理

黃酮類化合物本身的熒光強度很小，而鋁離子與黃酮苷類物質（蘆?。┰谒嵝曰蛉鯄A性條件下能形成具有熒光特性的絡合物，可用于熒光檢測。在398 nm的激發波長下，用熒光光度計（激發、發射光譜狹縫均為10 nm）在一定條件下對生成的蘆丁熒光絡合物進行熒光強度測定，根據熒光強度的大小優化蘆丁的最佳檢測條件。

1.2.2 蘆丁檢測條件的單因素試驗

在蘆丁與硝酸鋁形成蘆丁熒光絡合物的反應體系中，分別對緩沖溶液加入量、緩沖溶液pH、0.5%硝酸鋁溶液用量、反應時間、蘆丁溶液的濃度等單因素進行考察。

1.2.2.1 緩沖溶液pH的影響

準確移取6份3.026 mg/mL的蘆丁溶液0.145 mL，分別加入0.1 mL 0.5%硝酸鋁溶液，及1 mL不同pH的緩沖溶液后，用50%乙醇定容至10 mL，振蕩均勻、靜置15 min后，測定不同pH的緩沖溶液對蘆丁熒光絡合物的影響，根據測得熒光強度的大小選擇緩沖溶液的最優pH。

1.2.2.2 醋酸-醋酸鈉緩沖溶液加入量的影響

準確移取6份3.026 mg/mL的蘆丁溶液0.145 mL，分別加入0.1 mL 0.5%硝酸鋁溶液，及pH 5.5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液0.1，0.3，0.5，0.7，0.9和1.0 mL，用50%乙醇溶液定容至10 mL，振蕩均勻、靜置15 min后，測定熒光強度，根據熒光強度的大小判斷緩沖溶液最佳加入量。

1.2.2.3 濃度0.5%硝酸鋁溶液用量的影響

準確移取7份3.026 mg/mL的蘆丁溶液0.145 mL，分別加入0.1，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0和3.5 mL 0.5%硝酸鋁溶液，加入pH 5.5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液0.9 mL，用50%乙醇溶液定容至10 mL，振蕩均勻、靜置15 min后，測定熒光強度，根據熒光強度的大小判斷0.5%硝酸鋁溶液的最佳用量。

1.2.2.4 反應時間對蘆丁檢測的影響

準確配制14組在所得到的最佳試劑條件下的硝酸鋁和蘆丁生成的熒光絡合物溶液，在不同反應時間下測定熒光強度，根據熒光強度的大小判斷最佳反應時間。

1.2.2.5 不同質量濃度的蘆丁溶液的影響

準確移取3.026 mg/mL的蘆丁溶液0.145，0.125，0.110和0.100 mL，分別加入0.1 mL 0.5%硝酸鋁溶液，及pH 5.5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液0.9 mL后，用50%乙醇溶液定容至10 mL，振蕩均勻、靜置60 min后，測定熒光強度，根據熒光強度的大小判斷蘆丁溶液的最佳濃度。

1.2.3 響應面法優化蘆丁的檢測條件

根據單因素試驗結果，選定3個主要影響因素，蘆丁質量濃度、硝酸鋁用量、緩沖溶液pH這3個因素為自變量，以生成的絡合物的熒光強度為響應值，采用三因素三水平響應面[7]分析法模型，擬合最佳的測試條件，響應面法因素水平見表1。

表1 因素與水平

2 結果與分析

在激發波長398 nm下，分別對空白溶液以及蘆丁熒光絡合物溶液的熒光強度進行測定，從圖1的熒光圖譜中發現在510～550 nm發射波長范圍內進行蘆丁絡合物的熒光強度測定時溶液中其他成分基本不干擾測定。

2.1 單因素試驗檢測

2.1.1 醋酸-醋酸鈉緩沖溶液的pH影響

在激發波長398 nm檢測條件下，不同pH的緩沖溶液對熒光強度的影響如圖2所示。熒光強度隨酸性減弱呈現先增大后減小趨勢，pH 5.5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中熒光強度最強。

2.1.2 醋酸-醋酸鈉緩沖溶液加入量的影響

在激發波長398 nm，緩沖液pH 5.5的檢測條件下，醋酸-醋酸鈉緩沖溶液的加入量變化對蘆丁檢測的影響結果如圖3所示。蘆丁檢測的熒光強度隨緩沖溶液加入量增加而增大，加入量達到0.9 mL時，熒光強度值最大，超過0.9 mL，熒光強度明顯減小。

圖1 空白溶液的熒光對照圖譜

圖2 不同pH的緩沖溶液對蘆丁檢測的影響

圖3 醋酸-醋酸鈉緩沖溶液加入量對蘆丁檢測的影響

2.1.3 濃度0.5%硝酸鋁溶液用量對蘆丁檢測的影響

在398 nm的激發波長，0.9 mL pH 5.5的緩沖溶液檢測條件下，硝酸鋁用量變化對測定的影響結果如圖4所示。蘆丁檢測的熒光強度隨硝酸鋁用量的增加而增大，用量達到2.5 mL，檢測熒光強度最大，超過2.5 mL，檢測熒光強度隨硝酸鋁用量增加反而降低。

2.1.4 反應時間對蘆丁檢測的影響

在激發波長398 nm，0.9 mL pH 5.5的緩沖溶液，2.5 mL濃度0.5%硝酸鋁溶液的檢測條件下，反應時間對熒光測定的影響結果如圖5所示。熒光強度隨反應時間增加而增大，靜置時間60～65 min時，熒光強度最大，超過65 min，熒光強度隨時間增加反而降低?？紤]到實際試驗中所存在的誤差，最佳反應時間選用60 min。

圖4 硝酸鋁溶液用量對蘆丁檢測的影響

圖5 反應時間對蘆丁檢測的影響

2.1.5 不同蘆丁質量濃度對檢測的影響

在激發波長398 nm，靜置反應時間60 min，硝酸鋁用量2.5 mL，pH 5.5緩沖溶液體積0.9 mL的測定條件下，不同濃度的蘆丁溶液對熒光強度的影響結果如圖6所示。在蘆丁稀釋質量濃度從30.26～43.87 mg/L的變化范圍內，熒光強度隨著蘆丁質量濃度增加呈現先增大后減小趨勢，最佳質量濃度為37.83 mg/L。

圖6 蘆丁質量濃度對黃酮檢測的影響

2.2 響應面法優化分析蘆丁的檢測條件

利用響應面法優化軟件Design-Expert. V 8.0.6.1對表1的三因素三水平設計的17組試驗進行檢測，結果如表2所示。

表2 黃酮檢測條件響應面設計及結果

對試驗結果進行響應面法分析，得到蘆丁絡合物熒光強度與所選三因素之間的二次項回歸方程為：F=374.32-2.45A+10.15B+70.28C-2.10AB-1.00AC+20.45BC-11.91A2-28.91B2-176.71C2。方程的各系數絕對值大小反映出各因素對蘆丁絡合物熒光強度的影響。對表2進行檢驗模型有效分析，分析結果見表3。

從表3可以得到試驗模型分析的F=280.53，且概率p＜0.000 1，說明該模型具有極高的顯著性。其次，數據擬合分析中的失擬項F=6.19，概率p＞0.05，顯示失擬項并不顯著，說明在回歸區域中回歸方程的擬合性比較好。一次項中最顯著因素是C緩沖溶液pH，較顯著因素是B硝酸鋁用量，二次項中最顯著因素和較顯著因素與一次項相同，說明3因素分別對熒光檢測結果的影響程度。

表3 響應面回歸模型ANOVA分析結果

從曲面圖和對應的等高線圖，可進一步進行直觀分析。從圖7和圖8，可以看到蘆丁質量濃度與0.5%硝酸鋁用量的曲面圖曲面比較平緩，陡峭幅度較小，等高線圖形雖然是橢圓形但橢圓程度不大，說明兩者之間的相互作用不是很顯著。

圖7 硝酸鋁用量和蘆丁質量濃度對熒光強度的響應面圖

圖8 硝酸鋁用量和蘆丁質量濃度對熒光強度的等高線圖

在圖9和圖10中，蘆丁質量濃度與緩沖溶液pH的曲面圖陡峭程度比較好，對應的等高線圖形呈現橢圓，隨著緩沖液pH的改變，蘆丁檢測的熒光強度變化比較大，顯示兩者之間的交互作用較好。

圖9 緩沖液pH和蘆丁質量濃度對熒光強度影響的響應面圖

圖10 緩沖溶液pH和蘆丁質量濃度對熒光強度影響的等高線圖

在圖11和圖12中，緩沖溶液pH與0.5%硝酸鋁用量之間，曲面圖同樣比較陡峭，并且對應的等高線圖形明顯呈現橢圓狀，說明兩者之間的交互作用較顯著。

圖11 緩沖溶液pH和硝酸鋁用量對熒光強度影響的響應面圖

圖12 緩沖溶液pH和硝酸鋁用量對熒光強度影響的等高線圖

3 結論

通過在對影響蘆丁檢測的各單因素進行優化的基礎上，利用響應面法優化軟件Design-Expert. V 8.0.6.1對蘆丁質量濃度、緩沖溶液pH，硝酸鋁溶液的用量3個因素進行3水平優化設計，并對試驗模型進行討論，對各因素相互作用的響應面圖及等高線圖進行析，發現蘆丁質量濃度對檢測條件影響不大，0.5%硝酸鋁用量因素的影響較大，緩沖溶液pH的影響效果最顯著，且蘆丁的最佳檢測工藝條件為：蘆丁質量濃度37.78 mg/L，0.5%硝酸鋁2.76 mL，緩沖溶液pH 5.61。