miR-1294對上皮性卵巢癌細胞增殖及細胞周期的影響*

郭桃英 ，徐海英 ，陳文娟 ，潘玫 ，吳謀喜 ，代翔

（1.江西省九江市婦幼保健院婦科，九江 332000；2.江西省婦幼保健院腫瘤科，南昌 332000）

卵巢上皮性癌 (epithelial ovarian cancer，EOC)是全球女性生殖細胞最常見的惡性腫瘤之一[1]，約占卵巢惡性腫瘤的90%，惡性程度高，病情發(fā)展快，患者的五年生存率約為30%-40%[2,3]。早期篩查有可能大大降低EOC的死亡率[4]。卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展是一個復雜的過程，包括原癌基因的激活、抑癌基因失活等多種分子改變。研究發(fā)現(xiàn)，HER-2作為一種促癌基因,與轉(zhuǎn)錄因子EGR-1在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，對判斷卵巢癌的預后有一定的指導意義[5]。因此，尋找新的生物學標志物以進行早期診斷和對其進行靶向治療是非常必要的。

微小RNA（miRNA）是一種非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平影響靶基因表達[6]。miRNA通過細胞增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲影響癌癥的發(fā)展[7]。近來有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-183的表達與癌癥的預后相關，能調(diào)節(jié)癌細胞增殖以及提高抗腫瘤藥物在EOC中的敏感性[8]。miRNA-100的表達降低和miRNA-203表達增加與EOC的進展及預后不良有關[9]。有研究報道，miR-1294已被發(fā)現(xiàn)為某些腫瘤中的腫瘤抑制因子，miR-1294通過直接調(diào)節(jié)TPX2抑制細胞增殖并增強神經(jīng)膠質(zhì)瘤對替莫唑胺的化療敏感性[10]。miR-1294的表達下調(diào)能提高c-MYC表達，與食管鱗癌患者的預后不良有關[11]。目前有關miR-1294與上皮性卵巢癌的研究尚未見報道。本研究擬探討miR-1294與上皮性卵巢癌細胞增殖能力的關系。

1 材料與方法

1.1 細胞 培養(yǎng) 卵巢癌細胞株 SW626，A2780，SKOV3，OVCAR3及卵巢表面上皮細胞系（HOSEpiC）購于中國科學院上海生物科學所細胞庫。脂質(zhì)體Lipofectamine3000 Reagent購自美國Invitrogen 公 司 ，hsa-miR-1294mimics，hsa-miR-1294 inhibitor及mimics NC、inhibitor NC均由廣州銳博生物科技有限公司合成和純化。所有細胞在DMEM 培 養(yǎng) 基 （DMEM，Gibco，Gaithersburg，MD，USA）中培養(yǎng)，在37℃、含有5%CO2的加濕環(huán)境下 補 充 10%胎 牛 血 清（FBS，Gibco，Gaithersburg，MD，USA）。細胞貼壁生長，用0.25%胰蛋白酶/EDTA消化分散細胞，每3d傳代一次。

1.2 qRT-PCR檢測miRNA-1294的表達 根據(jù)使用說明，使用 Trizol試劑（TaKaRa，Dalian，China）提取總RNA。使用Prime Script RT Reagent試劑盒（Takara，Dalian，China） 加 入 1μg 總 RNA 合 成cDNA。 采用 SYBR Premix ExTaqTM II（TaKaRa，Dalian，China）對miR-1294的表達水平進行分析。使用ABI PRISM 7000序列檢測系統(tǒng)（Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA） 檢測 miR-1294的表達。qRT-PCR的反應條件如下：95℃，10min，然后 95℃，5s；55℃，30s；72℃，30s，40 個循環(huán)。U6表達用作內(nèi)對照。miR-1294的引物如下：miR-1294- 正 向 ：5'-TATGATCTCACCGAGTCCT-3'，miR-1294-反向：5'-TATGATCTCACCGAGTCCT-3'。使用2-ΔΔCt方法計算倍數(shù)變化。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染 根據(jù)以上實驗結(jié)果，選取相對低表達miR-1294的細胞株SKOV3和OVCAR3，采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染細胞，轉(zhuǎn)染mimics NC作為過表達的對照組，hsa-miR-1294mimics作為過表達組；轉(zhuǎn)染inhibitor NC作為抑制對照組，hsa-miR-1294 inhibitor作為抑制組。使用相同體積的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染Lipofectamine 3000作為空白對照組。轉(zhuǎn)染8 h后，10%胎牛血清的DMEM換為無血清培養(yǎng)基，在37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后卵巢癌細胞株的miR-1294表達情況。其值越高，表示該細胞株的miR-1294表達量越高。

1.4 CCK 8法檢測細胞增殖實驗 將轉(zhuǎn)染后的SKOV3 和 OVCAR3（2×104/孔）細胞接種到 96 孔板中,37℃ 5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)24h,48h,72h和96h。隨后,將CCK8溶液加入每個孔中并再陪育2h。使用微量滴定板讀數(shù)器 （Tecan Infinite 200 PRO;Salzburg，Austria）檢測細胞增殖,吸光度為 450nm。其吸光度越高表示細胞株的增殖率越高。

1.5 細胞周期分析 將轉(zhuǎn)染48h后的細胞株SKOV3和OVCAR3及空白對照組細胞用于細胞周期分析。細胞在4℃，冰冷的70%乙醇中固定一整晚。然后用50g/L PI染色，50g/L RNase處理。使用流式細胞儀 （FACScan;BD Biosciences，San Jose，CA，USA）分析細胞周期。

1.6 統(tǒng)計學處理 使用SPSS 17.0進行數(shù)據(jù)分析，研究結(jié)果數(shù)據(jù)表示為正態(tài)分布計量資料均數(shù)±標準差，組間差異采用兩獨立樣本的t檢驗分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同細胞系中miR-1294表達量 qRT-PCR檢 測 卵 巢 癌 細 胞 系 SW626，A2780，SKOV3 和OVCAR3及卵巢表面上皮細胞系 （HOSEpiC）中miR-1294的相對表達量，HOSEpiC細胞系相對表達量為 1.00883±0.25393，SW626細胞系相對表達量為0.62309±0.15175，A2780細胞系相對表達量為0.56157±0.12126,OVCAR3細胞系相對表達量為0.45055±0.09466；SKOV3細胞系相對表達量為0.4677±0.12181。miR-1294在卵巢癌細胞系SW626，A2780，SKOV3和 OVCAR3 中的表達明顯低于卵巢表面上皮細胞系（HOSEpiC），且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見圖1)，這提示miR-1294可能在卵巢癌組織中發(fā)揮著重要的生物學功能。

圖1 qRT-PCR驗證卵巢癌細胞系及卵巢表面上皮細胞系（HOSEpiC）中miR-1294的表達

2.2 miR-1294對上皮性卵巢癌細胞增殖的影響CCK-8檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-1294 mimics后的OVCAR3細胞系及SKOV3細胞系增殖能力顯著被抑制，在轉(zhuǎn)染24h、48h及72h相比于空白對照組和mimics NC組，差異具有統(tǒng)計學意義。轉(zhuǎn)染miR-1294 inhibitor后的OVCAR3細胞系及SKOV3細胞系24h、48h及72h相比于空白對照組和inhibitor NC組，能有效促進卵巢癌細胞的增殖活性 (P＜0.05，見圖2、圖 3)。

圖2 cck-8法檢測miR-1294對OVCAR3卵巢癌細胞增殖能力的影響

圖3 cck-8法檢測miR-1294對SKOV3卵巢癌細胞增殖能力的影響

2.3 miR-1294對卵巢癌細胞增殖周期的影響 流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-1294mimics的OVCAR3細胞系與miR-1294mimics NC組比較，其S期細胞平均比例分別為 (15.74±1.38)%和(27.61±2.59)%，G1期細胞比例分別為(69.11±3.28)%和(53.47±4.34)%。轉(zhuǎn)染miR-1294mimics的OVCAR3細胞系S期細胞增殖指數(shù)較低，而停留在G1期的細胞比例則較高，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見圖 4)。 轉(zhuǎn)染 miR-1294mimics的 SKOV3細胞系與空白對照組比較，其S期細胞平均比例分別為(15.37±0.91)%和(27.07±4.08)%，G1期細胞比例分別為 (69.09±2.05)%和 (54.02±3.20)%。轉(zhuǎn)染miR-1294mimics的SKOV3細胞系的細胞S期細胞增殖指數(shù)較低，而停留在G1期的細胞比例則較高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見圖5)。

圖4 轉(zhuǎn)染miR-1294mimics對OVCAR3卵巢癌細胞周期的影響

圖5 轉(zhuǎn)染miR-1294mimics對SKOV3卵巢癌細胞周期的影響

3 討論

卵巢惡性腫瘤具有異質(zhì)性和多樣性。發(fā)病率居婦科惡性腫瘤第三位，但死亡率最高。由于缺乏早期安全和無創(chuàng)的檢測方法，患者一經(jīng)發(fā)現(xiàn)多為晚期并提示高度惡性。因此，探討其發(fā)病機制及尋找有效治療方法至關重要。

近年來，有關EOC發(fā)生發(fā)展的潛在分子機制已經(jīng)取得了顯著的進步[12]。研究顯示，細胞增殖抑制基因Mfn2上調(diào)可抑制卵巢癌細胞增殖[13]。更多研究發(fā)現(xiàn)MircroRNA可作為診斷和預后的生物學標志物。從腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移方面研究發(fā)現(xiàn)，miRNA發(fā)揮重要抑癌基因或癌基因作用[14-16]，就組織敏感性、特異性、降解難易度及檢測方便度來講，mi R NA是 腫瘤早期診斷、腫瘤標志物及分子治療靶向的研究方向[17,18]。在EOC進展中，miR-9通過靶向SDF-1/CXCR4途徑起到上皮性卵巢癌細胞增殖的腫瘤抑制劑的作用[19]。miR-429的下調(diào)通過靶向ZEB1促進上皮性卵巢癌耐藥性的發(fā)展[20]。MicroRNA-298通過調(diào)節(jié)EZH2的表達來抑制上皮性卵巢癌的惡性表型[21]。MiR-26b/KPNA2軸通過下調(diào)OCT4抑制上皮性卵巢癌的增殖和轉(zhuǎn)移[22]。因此，這些證據(jù)表明，mircroRNA在EOC進展中起著至關重要的作用。但是，有關miR-1294在上皮性卵巢癌中的作用仍然未知。

在本研究中，我們以上皮性卵巢癌細胞系為研究對象，我們發(fā)現(xiàn)卵巢癌細胞株SW626，A2780，SKOV3和OVCAR3及卵巢表面上皮細胞系（HOSEpiC）中miR-1294均有表達，與HOSEpiC相比，SW626，A2780，SKOV3 和 OVCAR3 中的 miR-1294表達均較低。將miR-1294轉(zhuǎn)染至SKOV3和OVCAR細胞后，細胞增殖情況測定顯示，miR-1294過表達顯著抑制細胞增殖能力。細胞周期分析顯示，miR-1294的過表達導致S期細胞數(shù)量顯著減少，而停留在G1期的細胞比例則較高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。因此，上述結(jié)果表明增加miR-1294表達能抑制EOC細胞生長。

綜上所述，miR-1294在上皮性卵巢癌的增殖與進展中發(fā)揮著某些調(diào)節(jié)作用，這為探索上皮性卵巢癌的發(fā)病機制以及尋找新的基因治療靶點提供了依據(jù)。