環境DNA技術在生態保護和監測中的應用

張 輝 , 線薇薇

(1. 中國科學院海洋研究所 中國科學院海洋生態與環境科學重點實驗室, 山東 青島 266071; 2. 青島海洋科學與技術試點國家實驗室 海洋生態與環境科學功能實驗室, 山東 青島 266237; 3. 中國科學院海洋大科學研究中心, 山東 青島 266071)

生物多樣性是全人類最終所依賴的所有尺度上生態系統服務的最初支撐者, 也是人類生存和發展的基礎, 它與“全球變遷”和“持續發展”同被列為當代生態學和環境科學的三大前瞻性領域[1]。近一個世紀以來, 隨著人類活動的不斷加劇, 生物多樣性和生態系統遭到了嚴重的破壞, 物種滅絕的速度不斷加快, 人類賴以生存的生態系統中 60%已處于持續退化狀態, 自然資源的三分之二已被損耗, 生物多樣性減少、生態系統功能退化、全球氣候變化等早已成為全球性的重大問題[2]。

基于此背景, 在避免對當前生態環境再破壞的前提下, 開展全面準確的生態監測來查清和明確生物多樣性, 對生態保護和可持續利用具有極其重要的意義。環境DNA技術(eDNA)的發展就提供了一種生態和生物多樣性監測監測的新手段。該技術樣品采集簡單易行, 是一種便捷地、環境友好型地大范圍生態監測技術。

eDNA, 是指環境中存在的 DNA, 在大型生物研究中主要指生物脫落在環境中的組織或者細胞內含有的 DNA, 例如皮毛、黏膜、糞便等[3]。通過采集 eDNA樣品, 基于測序技術(現在通常使用第二代測序技術, 即高通量測序)監測調查區域的生物種類,稱為環境DNA宏條形碼技術(圖1)。

圖1 環境DNA宏條形碼技術——以海洋魚類為例Fig. 1 Workflow of eDNA metabarcoding in the research on marine fishes

1 環境DNA技術的發展

eDNA技術在水生生態系統中應用的靈感, 來自于 20世紀 90年代利用潛水采集到的糞便來識別座頭鯨(Megaptera novaeangliae), 抹香鯨(Physeter macrocephalus)及露脊鯨(Eubalaena glacialis)等的相關研究中[3]。而世界上首例證明eDNA適用于水生生態系統的研究是2008年Ficetola 等對美國牛蛙入侵的報道[4]。該研究表明即使目標水域內的牛蛙數量很少(例如每平方公里水域僅有1～2只牛蛙), 亦可通過eDNA將該物種檢測出來。

此后, 一些對不同水環境、不同生物門類的研究均驗證了eDNA在物種檢測中的有效性和靈敏性。例如, 美國水產生物保護中心進行的一項大型研究開發了在大湖系統的運河中檢測白鰱(Hypophthalmichthys molitrix)和鳙(H.nobilis)等物種的 eDNA 技術[5]。Goldberg等通過測試多種DNA提取和PCR方法完善了eDNA技術, 以檢測源頭水流中的蠑螈(Dicamptodon aterrimus)和尾蟾落基山亞種(Ascaphus montanus)[6]。Thomsen等[7]表明基于eDNA技術對于甲殼動物、水生昆蟲、水生哺乳動物以及鳥類和陸生哺乳動物等的監測是有效的。2012年以來, 利用eDNA檢測脊椎動物的論文大量增加, 其中包括綜述論文, 如“環境DNA生態學研究及其在保護遺傳學中的應用”[8], “基于eDNA的野生生物及生物多樣性監測”[9]和“基于eDNA對水生動物的監測——生態學研究中 eDNA作為調查工具的綜述”[10]以及生物保護集刊《環境DNA： 生物保護的高效新工具》中的12篇研究論文對eDNA在生物保護學領域的應用進行了報道等等[11]。這些研究為 eDNA技術在水生生態系統, 尤其是海洋生態系統監測中的應用奠定了必要的基礎(圖2)。

圖 2 環境DNA研究發展概略圖Fig. 2 Overview of the research history of eDNA

2 國際上環境DNA技術在生態監測中的應用

國際上相關研究驗證了 eDNA技術在生態監測中的有效性和靈敏性。Bálint 等[12]綜述了最近的研究成果, 強調 eDNA為生態研究提供了強有力的新時態數據來源, 并討論了基于 eDNA技術的潛在研究方向, 概述了相關挑戰。《2018研究前沿》[13]顯示在生態與環境科學領域, eDNA技術監測生物多樣性連續第2年入選熱點研究前沿(圖3)。本研究主要對eDNA技術在生態監測中的幾個主要方向進行介紹。

圖3 生態與環境科學領域Top10 熱點前沿的施引論文Fig. 3 Top 10 research topics in the fields of ecology and environment science注： 改編自《2018研究前沿》[13]

2.1 環境 DNA技術與傳統監測方法的互補性

野生生物資源調查通常使用網具進行, 這在監測高豐度物種時較為可靠, 而對低豐度、珍惜、瀕危物種的捕獲概率較低, 隨著野生生物資源不斷減少,傳統資源調查得到的結果會存在較大誤差[14]。研究表明, eDNA方法比傳統的調查方法更為靈敏、有效。Dejean等[15]在外來物種入侵研究中, 以兩種美國牛蛙為研究對象, 將傳統調查方法與 eDNA技術進行了比較, 結果表明 eDNA技術更加便捷有效。Davy等[16]利用 eDNA方法對 8種淡水龜進行了監測, 結果表明 eDNA方法在龜類資源調查和監測中具有適用性, 可以推廣至瀕危龜類物種的監測等領域。Sigsgaard等[17]在丹麥水域同時使用傳統調查方法和eDNA技術對泥鰍進行了監測, 結果表明eDNA方法結果可靠, 且所需成本較小。Smart等[18]認為eDNA方法比傳統方法在水生生物分類領域更高效, 并就優化eDNA的成本進行了探索。Evans等[19]以美洲紅點鮭(Salvelinus fontinalis)為研究對象比較了電擊法和 eDNA方法的優劣, 表明 eDNA方法更加省時省力, 約能節省67%的成本, 因此eDNA可以成為電擊法調查的有力補充。

2.2 基于環境 DNA技術監測物種生活史過程

由于 eDNA技術對目標物種的干擾和生態系統的破壞性較小, 因此可用于監測不同門類的物種,如日本大鯢(Andrias japonicus)[20]、泥鰍(Misgurnus fossilis)[21]、阿拉巴馬鱘(Scaphirhynchus suttkusi)[22]等。相關研究進一步表明, 通過監測eDNA濃度的變化, 可以實現對目標物種在特定區域的產卵場、索餌場及遷移路徑等生活史過程的監測和預測, 顯著提高了生態監測的效率, 同時降低了大量人工成本和科研成本。Spear等[23]利用 eDNA對隱鰓鯢(Cryptobranchus alleganiensis alleganiensis)進行資源調查發現在隱鰓鯢的繁殖期, 其 eDNA濃度處于最高值。Erickson等[24]基于 eDNA方法研究了鳙魚入侵的遷移路徑、產卵場位置, 發現了eDNA濃度與其遷移路徑的相關性。Buxton等[25]研究發現在疣螈(Triturus cristatus)繁殖期(6月開始)及稚魚期(8月中旬開始)水域中的eDNA濃度最高。Bylemans等[26]證明eDNA濃度變化可以作為監測瀕危物種澳洲麥氏鱸(Macquaria australasica)產卵行為的重要手段, 并有望在其他門類物種產卵過程中推廣使用。

2.3 基于環境DNA技術推算物種豐度

研究表明, 基于 eDNA濃度與物種生物量之間的正相關關系可以確定物種的豐度和區系分布。Pilliod等[27]在美國愛達荷州的13條河流中利用傳統野外調查方法和 eDNA方法采集了樣品進行比較研究, 結果表明 eDNA濃度與野外調查得到的生物密度、生物量等結果呈顯著正相關關系。Evans等[28]測定了9種動物(包括8種淡水魚類和1種兩棲動物)的 6個線粒體基因片段序列, 發現序列拷貝數與上述9種生物的豐度存在正相關關系, 提示eDNA具有生物豐度評價指標的潛力。Lacoursiere-Roussel等[29]認為關于 eDNA濃度與物種豐度之間關系的大量例證使得eDNA在漁業評估管理中具有廣泛應用前景。Doi等[30]基于日本佐波河水域浮潛調查研究, 證明了香魚(Plecoglossus altivelis)eDNA濃度與其豐度及生物量的關系, 結果表明 eDNA分析是估算魚類豐度/生物量以及它們在河流中的空間分布的有效工具。Salter等[31]比較了基于eDNA技術與傳統拖網調查結果, 發現大西洋鱈魚(Gadus morhua)的捕獲量與定量PCR結果呈顯著正相關關系, 提出eDNA技術可以用于重要海洋經濟魚類的區域性資源量評估。

2.4 基于環境DNA技術研究生態系統結構變化

生態系統結構變化是生態監測的重要方面, 通過 eDNA分析, 可以同時監測生物在多個營養級和群落中的動態變化, 從而提供與生態系統變化相關的生物間作用的關鍵信息。Djurhuus等[32]利用eDNA高通量測序技術, 基于加利福尼亞蒙特雷灣18個月(2015—2016年)的海水樣品, 研究了該生態系統中的生物多樣性, 推斷了群落結構變化及其與環境的關系, 提供了預期的捕食者與被捕食者之間的關系、營養級關系及季節性變化的證據, 認為基于 eDNA分析可以掌握海洋生態系統變化并為保護敏感生物提供依據。Holman等[33]基于eDNA調查了英國沿海4個碼頭的沉積物和水樣, 并與歷史結果進行了比較。結果發現了含多個新引進種在內的多個非本地種, 凸顯了 eDNA宏條形碼技術在非本地種早期檢測和時空監測中的實用性, 認為在是評估群落結構變化相關研究時需選擇不同類型的環境樣本。Sigsgaard等[34]在丹麥沿海進行了為期一年的水樣采集和浮潛觀察, 基于eDNA技術分析了水樣品, 并與已有的 7年歷史數據進行了比較。結果證明 eDNA鑒定的OTUs隨魚類群落結構的季節性變化而變化。盡管浮潛觀察結果與 eDNA結果存在差異, 但是通過浮潛觀察到的的絕大多數魚類都可以在 eDNA結果中獲得, 該研究證明了 eDNA在重建海水魚類群落結構季節變化中至關重要。

3 我國環境DNA技術在生態監測中的應用

國內學者近年來亦開展了 eDNA相關研究, 但總體仍處于起步狀態, 且大部分聚焦于淡水生態系統, 對海洋生態系統的研究報道較少。

徐浩等[35]、陳煉等[36]、趙明等[37]通過綜述介紹了環境DNA技術在生物多樣性和生態學研究領域中的應用。姜維等[38]以川陜哲羅鮭為目標物種, 對環境DNA 分析流程進行了設計優化; 劉軍等[39]對魚類環境DNA 研究中的通用引物進行了篩選驗證。徐念和常劍波[40]基于長江中下游干流環境 DNA樣本, 開展了魚類物種檢測的相關工作, 該研究從來源于 17 個采樣點的115條匹配成功的序列中檢測出了15 種魚類。孫晶瑩等[41]研究表明 eDNA 宏條形碼技術可實現對浮游動物物種的半定量檢測, 在生物多樣性監測和生物完整性評價有顯著的應用價值。李苗等[42]建立了一套中國對蝦 eDNA 技術的操作流程, 提高了中國對蝦的檢出率。Zhang等[43]基于eDNA技術研究了長江口及其鄰近水域魚類群落結構的季節變化特征。結果顯示： eDNA技術適用于長江口及其鄰近水域的資源監測, 與傳統方法相比更加靈敏和有效。張輝和線薇薇開發了一種收集海水中環境DNA的裝置[44]。陳治等[45]以曼氏無針烏賊(Sepiella japonica)為研究對象, 通過絕對定量技術建立和優化了舟山近海高濁度水樣 eDNA的獲取方法, 建立了舟山近海水樣大生物 eDNA最適獲取方法, 為相似水域的水樣采集及eDNA提取提供了借鑒參考。

4 結論與展望

eDNA技術的優勢使其能夠作為傳統資源調查的有力補充, 在生態保護和監測中能夠發揮重要作用, 已在美國、日本等發達國家廣泛應用。我國的相關研究, 尤其是在海洋領域的研究十分匱乏, 亦應當穩步開展、不斷加強, 充分發揮eDNA技術的優勢服務于生態保護。

需要指出的是, 任何技術的發展都會存在一系列挑戰。在eDNA技術研究中, 亦存在一些問題。例如, 在海洋監測中, 海水樣品高質量保存與提取難度大; 野外現場水樣品容易被污染; 不同門類選擇的通用引物尚沒有統一認識; 在鑒定OUTs時往往依賴于相關數據庫中的已有序列, 而當數據庫中不存在該物種的相關信息或者信息存在錯誤時, 物種鑒定結果就不準確; 雖然有大量研究嘗試了基于qPCR產物濃度或者 PCR序列數量來推測生物量, 但基于eDNA技術計算生物量不僅流程復雜, 而且其結果與實際情況通常存在較大差距等等, 這些都是亟需科學工作者努力解決的問題。