基于UPLC-Q-TOF-MS法分析生、炙甘草中化學(xué)成分的差異性

崔園園 周永峰 馬艷芹 房吉祥 王國強(qiáng) 張蓉蓉 董旖 張萍

中圖分類號(hào) R284 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2020）09-1049-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.09.06

摘 要 目的：比較生、炙甘草的化學(xué)成分差異，為闡明甘草炮制前后化學(xué)成分的變化規(guī)律以及甘草生熟異用的物質(zhì)基礎(chǔ)提供參考。方法：采用超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC -Q-TOF-MS）技術(shù)對(duì)生、炙甘草中成分進(jìn)行檢測(cè)，通過將所得化合物的保留時(shí)間、相對(duì)分子量等信息與METLIN、安捷倫MassHunter PCDL Manager離線成分鑒定工作站等數(shù)據(jù)庫以及相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行比對(duì)后，對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行初步鑒定。采用主成分分析（PCA）法觀察樣本的整體分布趨勢(shì);采用正交偏最小二乘法（OPLS-DA）法對(duì)差異性化合物進(jìn)行篩選[以變量投影重要度（VIP）>1.0和 | P（corr） | ≥0.5為標(biāo)準(zhǔn)]，并分析差異性化合物的含量變化。結(jié)果：從生、炙甘草中初步鑒定出了31個(gè)共有化合物。PCA分析結(jié)果顯示，生、炙甘草樣本均能夠較好地分離。OPLS-DA分析結(jié)果顯示，在生、炙甘草中共篩選出了15個(gè)特征差異性化合物，包括黃酮類化合物13個(gè)、香豆素類化合物2個(gè);甘草蜜炙后甘草黃酮A、甘草素以及光甘草定等8種黃酮類化合物的含量顯著升高（P<0.05或P<0.01），甘草黃酮醇、甘草寧A等5種黃酮類化合物以及2′，4′-三羥基-5-甲氧基-3-芳香豆素、紅花巖黃芪香豆雌酚B等2種香豆素類化合物的含量顯著降低（P<0.01）。結(jié)論：甘草炮制前后部分黃酮類和香豆素類化合物存在明顯的差異，這些差異性化合物可能是甘草生熟異用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 生甘草;炙甘草;超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜;主成分分析法;正交偏最小二乘法;差異性化合物

Differences Analysis of Chemical Composition of Raw and Fried Glycyrrhiza uralensis Based on UPLC-Q- TOF-MS

CUI Yuanyuan，ZHOU Yongfeng，MA Yanqin，F(xiàn)ANG Jixiang，WANG Guoqiang，ZHANG Rongrong，DONG Yi，ZHANG Ping（Medical Supplies Center ， PLA General Hospital， Beijing 100039， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To compare the chemical composition differences of raw and fried processed Glycyrrhiza uralensis， and provide reference for clarifying the regularity of chemical composition change before and after processing and material basis of differential use of raw and fried G. uralensis. METHODS： UPLC-Q-TOF-MS technology was used to detect the composition of raw and fried G. uralensis. By comparing the retention time， relative molecular weight and other information of the compounds with the databases such as METLIN， Agilent MassHunter PCDL Manager off-line component identification workstation and references， the chemical compositions of the compounds were preliminarily identified. Principal component analysis （PCA） method was used to observe the overall distribution trend of samples. Orthogonal partial least square （OPLS-DA） method was used to screen differential compounds [VIP>1.0 and | P（corr） |≥0.5 as criteria] and analyze the content changes of differential compounds. RESULTS： A total of 31 common compounds were preliminarily identified from the raw and fried G. uralensis. PCA analysis showed that raw and fried G. uralensis could be separated well. OPLS-DA analysis result showed that 15 characteristic differential compounds were screened out from raw and fried G. uralensis， including 13 flavonoids and 2 coumarins; the contents of 8 flavonoids compounds such as licoflavone A， glycyrrhizin and glabridin and so on in G. uralensis were significantly increased （P<0.05 or P<0.01）， while the contents of 5 flavonoids components such as glycyrrhizinol， glycyrin A and 2 coumarins components such as? 2′-4′-trihydroxy-5-methoxy-3-coumarim and hedysarimcoumestan B were significantly decreased （P<0.05） after honey-fried processing. CONCLUSIONS： Before and after processing， there are obvious differences between some flavonoids and coumarins， which may be the main material basis for differential use of raw and honey-fried G. uralensis.

KEYWORDS Raw Glycyrrhiza uralensis; Fried Glycyrrhiza uralensis; UPLC-Q-TOF-MS; Principal component analysis; Orthogonal partial least square method; Differential compounds

甘草為豆科植物甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）、脹果甘草（G. inflata Bat.）或光果甘草（G. glabra L.）的干燥根及根莖，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有補(bǔ)脾益氣、止咳平喘、清熱解毒、緩急止痛、調(diào)和諸藥之功，被列為上品[1]。千百年來，因其在臨床上使用頻次較高、藥效顯著而被稱為“藥之國老”[2]。目前，甘草的臨床應(yīng)用主要是生甘草和炙甘草兩種，兩者的區(qū)別在于甘草經(jīng)蜜炙后藥性由平轉(zhuǎn)溫，藥效由清轉(zhuǎn)補(bǔ)[3-4]。《藥性賦》記載：“甘草生則分身梢而瀉火，炙則健脾胃而和中”;《本草約言》云：“諸癰疽瘡瘍，紅腫未潰者，宜生用。其已潰與不紅腫者，宜蜜炙用”。以上記載均表明，自古以來生、炙甘草應(yīng)用區(qū)別明顯，不可互相代用[5]。然而，這種差異性在臨床應(yīng)用上是否具有科學(xué)依據(jù)，以及其物質(zhì)基礎(chǔ)如何，尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF-MS）作為一種快速而有效的多成分分析技術(shù)，具有靈敏度高、分離能力強(qiáng)、檢測(cè)范圍廣等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于中藥的化學(xué)成分分析[6-7]。因此，本研究擬采用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)分析生、炙甘草的化學(xué)成分差異，為闡明甘草炮制前后化學(xué)成分的變化規(guī)律以及甘草生熟異用的物質(zhì)基礎(chǔ)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1290 Infinity型UPLC儀、iFunel 6550型Q-TOF-? LC/MS系統(tǒng)、1290型二極管陣列檢測(cè)器均購自美國Agilent公司;KQSOODE型超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

生甘草（批號(hào)：1906073）和炙甘草（同批生甘草的蜜炙品）均由北京市雙橋燕京中藥飲片廠提供，經(jīng)解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心中藥研究所肖小河教授鑒定，均符合2015年版《中國藥典》（一部）甘草和炙甘草項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)[8];乙腈、甲醇、甲酸均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

參考文獻(xiàn)方法[9]制備供試品溶液。分別取生甘草和炙甘草適量，粉碎。精密稱取各樣品粉末1.6 g，分別置于50 mL錐形瓶中，加入50%甲醇20 mL后，精密稱定質(zhì)量;超聲（功率：250 W，頻率：30 kHz）提取 30 min，冷卻，再次稱質(zhì)量，并用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻;經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2 色譜條件

參考文獻(xiàn)方法[10]設(shè)置本研究的色譜條件。色譜柱：Agilent ZORBAX RRHD300 SB-C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）;柱溫：30 ℃;流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～2 min，14%B→23%B;2～10 min，23%B→30%B;10～11.5 min，30%B→34%B;11.5～12.5 min，34%B→42%B;12.5～15 min，42%B→61%B;15～17.5 min，61%B→70%B;17.5～24 min，70%B→90%B;24～25 min，90%B→14%B）;流速：0.3 mL/min;進(jìn)樣量：10? μL;掃描范圍：200～600 nm全波長掃描。

2.3 質(zhì)譜條件

參考文獻(xiàn)方法[9]設(shè)置本研究的質(zhì)譜條件。離子源：電噴霧離子源（ESI），正、負(fù)離子全掃描模式;毛細(xì)管電壓：3 500 V;噴嘴電壓：1 000 V;干燥氣溫度：200 ℃，干燥氣體積流量：11.0 L/min;霧化氣溫度：350 ℃，霧化氣體積流量：12.0 L/min;掃描質(zhì)量范圍：質(zhì)荷比（m/z）50～1 200。

2.4 樣品測(cè)定及數(shù)據(jù)處理

將“2.1”項(xiàng)下供試品溶液按“2.2”“2.3”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，記錄相關(guān)圖譜數(shù)據(jù)。

2.4.1 總離子流圖的建立 采用 Agilent Mass Hunter Profinder B.06.00軟件對(duì)正、負(fù)離子模式下生、炙甘草的質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。結(jié)果顯示，在正、負(fù)離子模式下，生、炙甘草中化學(xué)成分間均存在明顯差異，這表明蜜炙對(duì)甘草的化學(xué)成分具有一定的影響。總離子流圖見圖1。

2.4.2 化合物的鑒定 結(jié)合METLIN、安捷倫 MassHunter PCDL Manager 離線成分鑒定工作站等數(shù)據(jù)庫以及相關(guān)參考文獻(xiàn)[11-13]，對(duì)各化合物的保留時(shí)間、相對(duì)分子量等相關(guān)信息進(jìn)行識(shí)別后（數(shù)據(jù)過濾參數(shù)：質(zhì)量范圍為m/z 50～1 200，校正誤差為0.100，保留時(shí)間窗口為0.3 min），初步鑒定出了31個(gè)共有化合物。生、炙甘草中共有化合物鑒定結(jié)果見表1。

2.4.3 多元統(tǒng)計(jì)分析 將從質(zhì)譜中導(dǎo)出的原始數(shù)據(jù)經(jīng)過Profinder軟件處理后，共得到2 000個(gè)化合物的相對(duì)峰面積以及保留時(shí)間等相關(guān)數(shù)據(jù)，將處理后的數(shù)據(jù)以峰面積為變量導(dǎo)入SIMCA-P軟件中進(jìn)行無監(jiān)督的主成分（PCA）分析。結(jié)果顯示，在正、負(fù)離子模式下，生、炙甘草樣本均能得到較好的分離，這表明蜜炙對(duì)甘草的化學(xué)成分產(chǎn)生了顯著影響。生、炙甘草的PCA得分散點(diǎn)圖見圖2。

進(jìn)一步基于有監(jiān)督的正交偏最小二乘法（OPLS- DA）對(duì)甘草炮制前后的差異樣本進(jìn)行判別分析。以變量投影重要度（VIP）≥1.0和 | P（corr） |≥0.5為篩選條件對(duì)甘草炮制前后的差異化合物進(jìn)行篩選[14]，將篩選到的差異化合物與之前鑒定的化合物進(jìn)行對(duì)比，確定特征差異性成分。結(jié)果，共鑒定出了15個(gè)特征差異性成分，其中黃酮類13個(gè)、香豆素類2個(gè)。生、炙甘草的 OPLS-DA 得分圖和S-Plot圖見圖3。

2.4.4 特征差異性成分分析 質(zhì)譜圖譜的積分面積可以初步反映化合物的相對(duì)含量，因此對(duì)15個(gè)特征差異性成分的峰面積進(jìn)行手動(dòng)積分，比較甘草炮制前后特征差異性成分的相對(duì)含量變化。結(jié)果顯示，甘草經(jīng)蜜炙后，甘草素、甘草黃酮A、甘草異黃烷甲、光甘草定、喬松素、芹糖甘草苷、夏佛塔苷和異甘草苷等8種黃酮類化合物的含量顯著升高（P<0.05或P<0.01），而甘草黃酮醇、甘草寧A、山柰酚、毛蕊異黃酮、甘草寧C等5種黃酮類化合物和7， 2′，4′-三羥基-5-甲氧基-3-芳香豆素、紅花巖黃芪香豆雌酚B 等2種香豆素類化合物的含量則顯著降低（P<0.01）。生、炙甘草中特征差異性成分的含量變化情況見圖4。

3 討論

炮制是中醫(yī)臨床應(yīng)用的重要手段，能夠通過引起物質(zhì)基礎(chǔ)的化學(xué)變化而導(dǎo)致中藥藥性發(fā)生變化，進(jìn)而使藥材本身潛在價(jià)值得到充分挖掘[14]。明代醫(yī)學(xué)家陳嘉謨指出：“凡藥制造，貴在適中，不及則功效難求，太過則性味反失”，這充分說明了中藥炮制對(duì)臨床療效的重要作用。炙甘草是至今為止甘草沿用最為廣泛的炮制方法，被收錄至2015版《中國藥典》（一部）中，并單獨(dú)設(shè)立條目[8]。現(xiàn)代研究也證明，蜜炙后的甘草具有調(diào)和諸藥、加強(qiáng)滋補(bǔ)的作用[16-17]。

黃酮類化合物作為甘草的主要活性成分之一，是甘草屬植物中分布最廣的一類化合物[18-19]。張霞等[20]通過對(duì)甘草中黃酮類化合物的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，甘草素、光甘草定、異甘草苷等15個(gè)化合物在網(wǎng)絡(luò)分析中的連接度較高，是甘草發(fā)揮藥效的重要協(xié)同成分。本研究結(jié)果顯示，甘草炮制（蜜炙）后，甘草素、甘草黃酮A以及異甘草苷等8種黃酮類化合物的含量顯著升高，而甘草黃酮醇、甘草寧A以及毛蕊異黃酮等5種黃酮類化合物和7， 2′，4′-三羥基-5-甲氧基-3-芳香豆素、紅花巖黃芪香豆雌酚B等2種香豆素類化合物的含量則顯著降低，這提示上述差異性化學(xué)成分可能為甘草生熟異用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。結(jié)合張霞等[20]的研究結(jié)果，推測(cè)甘草素、光甘草定、芹糖甘草苷、異甘草苷4種黃酮類成分則可能是炙甘草的主要藥效成分。以上結(jié)論為甘草炮制前后的質(zhì)量控制及臨床應(yīng)用提供了一定的借鑒和參考，亦可為下一步的細(xì)胞及動(dòng)物藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究提供依據(jù)。

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（收稿日期：2020-02-07 修回日期：2020-03-23）

（編輯：林 靜）