基于TLR4/NF-κB途徑的白藜蘆醇減輕LPS致小鼠急性肺損傷的機制研究

楊世勇 何毅 宋大強 吳旭 章卓

中圖分類號 R285;R967 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2020）09-1034-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.09.03

摘 要 目的：觀察白藜蘆醇（Res）對脂多糖致急性肺損傷（ALI）小鼠的保護作用，并基于Toll樣受體（TLR4）/核因子κB（NF-κB）途徑探討其可能機制。方法：將昆明種小鼠分為正常組、模型組、陽性對照組（地塞米松，0.5 mg/kg）以及Res低、中、高劑量組（50、100、200 mg/kg），每組10只。正常組和模型組小鼠均灌胃生理鹽水，每日1次，連續7 d;陽性對照組小鼠腹腔注射地塞米松磷酸鈉注射液，每日1次，連續3 d;Res各劑量組小鼠灌胃相應藥物，每日1次，連續7 d。末次給藥后，除正常組外的其余各組小鼠均于鼻內滴注LPS（5 mg/kg）以復制ALI模型。采用Hoechst 33242染色法觀察各組小鼠肺泡灌洗液中的中性粒細胞凋亡情況，使用流式細胞術檢測其凋亡率;采用酶聯免疫吸附測定法檢測血漿中白細胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）含量;計算肺濕質量/干質量（W/D）比值;采用蘇木精-伊紅染色法觀察肺組織的形態學特征;采用Western blotting法檢測肺組織中TLR4、NF-κB的表達情況。結果：正常組小鼠肺泡灌洗液中凋亡中性粒細胞較少，肺組織結構完整，未見水腫、充血、滲出、炎癥細胞浸潤及其他炎癥表現。模型組小鼠肺泡灌洗液中凋亡中性粒細胞明顯增多，凋亡率顯著升高（P<0.01）;肺組織水腫、充血明顯，并可見紅色實變區;血漿IL-6和TNF-α含量、肺W/D比值、肺組織中TLR4和NF-κB的相對表達量均顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，各給藥組小鼠肺泡灌洗液中凋亡中性粒細胞明顯增多，凋亡率顯著升高（P<0.05或P<0.01）;肺組織上述癥狀均有不同程度的改善;血漿中IL-6和TNF-α含量、肺W/D比值以及肺組織中TLR4、NF-κB的相對表達量（除Res低劑量組外）均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。結論：Res對ALI模型小鼠具有一定的保護作用，其作用機制可能與抑制TLR4、NF-κB表達、從而減少炎癥因子TNF-α、IL-6分泌有關。

關鍵詞 白藜蘆醇;急性肺損傷;Toll樣受體4;核因子κB;炎癥因子;機制;小鼠

Study on the Mechanism of Resveratrol Attenuating LPS-induced Acute Lung Injury in Mice Based on? TLR4/NF-κB Pathway

YANG Shiyong1，2，HE Yi3，SONG Daqiang4，WU Xu1，ZHANG Zhuo1（1. Dept. of Pharmacology， School of Pharmacy， Southwest Medical University， Sichuan Luzhou 646000， China; 2. Dept. of Pharmacy， Deyang Peoples Hospital， Sichuan Deyang 618000， China; 3. Dept. of Urology， the Affiliated Hospital of Southwest Medical University， Sichuan Luzhou 646000， China; 4. Dept. of Pharmacy， the Affiliated Hospital of Southwest Medical University， Sichuan Luzhou 646000， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To observe the protective effects of resveratrol （Res） on LPS-induced acute lung injury （ALI） model mice， and to explore its possible mechanism based on TLR4/NF-κB pathway. METHODS： Kunming mice were divided into normal group， model group， positive control group （dexamethasone， 0.5 mg/kg）， Res low-dose， medium-dose and high-dose groups （50， 100， 200 mg/kg）， with 10 mice in each group. Normal group and model group were given normal saline intragastrically， once a day， for 7 days; positive control group were intraperitoneally injected with Dexamethasone sodium phosphate injection， once a day， for 3 days; Res groups were given relevant medicine intragastrically， once a day， for 7 days. After last administration， all the mice except the normal group were dripped LPS （5 mg/kg） into the nose to induce ALI model. The apoptosis of neutrophils in BALF was observed by Hoechst 33242 staining; the apoptosis rate of neutrophils were detected by flow cytometry. The contents of IL-6 and TNF-α in the plasma were detected by ELISA. After wet mass to dry mass （W/D） ratio of lung was calculated， the morphological characteristics of lung tissue were observed by HE staining. Western blotting assay was used to detect the expression of TLR4 and NF-κB in lung tissue. RESULTS： In normal group， there were few apoptotic neutrophils in the BALF， and the lung tissue structure was intact， without edema， hyperemia， exudation， inflammatory cell infiltration or other inflammatory manifestations. In model group， the number of apoptotic neutrophils in BALF increased， and the apoptotic rate of neutrophils were enhanced significantly（P<0.01）; edema and hyperemia of lung tissue were significantly increased， and the red consolidation area was observed; the contents of IL-6 and TNF-α in plasma， the ratio of lung W/D， the relative expression of TLR4 and NF-κB in lung tissue were significantly increased （P<0.01）. Compared with model group， the number of apoptotic neutrophils in BALF were increased， and the apoptotic rate of neutrophils were enhanced significantly （P<0.05 or P<0.01） above symptoms of lung tissue were improved to different extents; the contents of IL-6 and TNF-α in plasma， lung W/D ratio as well as relative expression of TLR4 and NF-κB in lung tissue （except for Res low-dose group） in administration groups were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： Res has a protective effect on ALI model mice， the mechanism of which may be related to reducing the generation of inflammatory cytokines TNF-α and IL-6 by inhibiting TLR4/NF-kB expression.

KEYWORDS? ?Resveratrol; Acute lung injury; TLR4; NF-κB; Inflammatory cytokines; Mechanism; Mice

急性肺損傷（Acute lung injure，ALI）主要表現為嚴重的肺部炎癥反應、急性呼吸窘迫綜合征或肺功能衰竭，重癥監護病房（ICU）患者的發病率為20%～40%，甚至可高達50%，病死率為30%～40%[1-2]。ALI的病因較為復雜，目前學者普遍認為該癥的發生與炎癥級聯反應、中性粒細胞黏附以及肺水腫等有關[3]。Toll樣受體4（TLR4）信號通路在炎癥反應中具有重要作用，參與了ALI的發病過程[4]。有研究指出，髓樣分化因子88（MyD88）依賴的TLR4信號通路被激活后，核因子κB（NF-κB）也被激活，后者可進一步促進腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素6（IL-6）等炎癥因子的釋放， 導致炎癥級聯反應的發生[5]。

白藜蘆醇（Resveratrol，Res）是一種多酚類化合物，在虎杖屬植物中含量豐富，具有抗炎、抗氧化、預防腫瘤發生、抑制細菌生長等作用[6]。鑒于Res的抗炎作用，本課題組推測其可能對脂多糖（LPS）誘導的ALI具有一定的減輕作用，并擬探索這一作用是否與TLR4/NF-κB關鍵因子的表達受到抑制有關。為此，本研究建立了ALI小鼠模型，通過檢測炎癥因子IL-6、TNF-α以及TLR4、NF-κB等指標的變化來探索Res對小鼠的保護作用及可能機制，以期為該化合物防治ALI提供理論依據，為該癥治療新靶點的挖掘提供參考。

1 材料

1.1 儀器

SpectraMax M3型酶標儀（美國MDS公司）;SBK-YLQX-003552型流式細胞儀（美國BD公司）;PAC300型電泳槽和轉膜儀、ChemiDoc XRS+System/Image Lab Software型凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司）;TCS SP5型激光共聚焦掃描顯微鏡（德國Leica公司）;CX23型生物顯微鏡（日本Olympus公司）;DHG-9147A型恒溫干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）;THM 75005289型離心機（美國Thermo Fisher Scientific公司）;DSH2-300型恒溫振蕩儀（太倉市實驗設備廠）;Milli-Q Synthesis型超純水系統（美國Millipore公司）。

1.2 藥品與試劑

白藜蘆醇對照品（成都普斯生物科技股份有限公司，批號：20180207，純度：99%）;地塞米松磷酸鈉注射液（陽性對照，后文簡稱“地塞米松”，辰欣藥業股份有限公司，批號：20180311，規格：1 mL ∶ 5 mg）;牛血清白蛋白（BSA）、LPS（美國Sigma公司）;兔源β-肌動蛋白（β-actin）、NF-κB、TLR4抗體（美國Abcam公司，批號分別為F1218、M1018、A0712）;辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG二抗、CCK-8試劑盒、ECL化學發光顯色液、Hoechst 33242染色液、膜聯蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexin Ⅴ-FITC/PI）染色試劑盒、蛋白提取試劑盒（碧云天生物技術研究所，批號分別為A0208、20180711、20180621、C1027、C1062L、P0013B）;IL-6、TNF-α酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（武漢優爾生科技股份有限公司，批號分別為20180313、20180411）;蘇木精-伊紅（HE）試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號分別為20180612、20180521）;氯化鈉注射液（回音必集團江西東亞制藥有限公司，批號：2018021822，規格：250 mL ∶ 2.25 g，作生理鹽水用）;其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 動物

SPF級昆明種小鼠，雌雄各半，體質量18～22 g，由西南醫科大學實驗動物中心提供，動物生產許可證號：SCXK（川）2018-17。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

取小鼠60只，適應性喂養7 d后，隨機分為正常組、模型組、陽性對照組（地塞米松，0.5 mg/kg，以生理鹽水為溶劑，劑量設置參考文獻[7]）以及Res低、中、高劑量組（50、100、200 mg/kg，以生理鹽水為溶劑制成混懸液，使用前搖勻，劑量設置參考文獻[7]），每組10只。造模前，Res各劑量組小鼠按1 mL/100 g灌胃相應藥物，每日1次，連續7 d;陽性對照組小鼠按0.1 mL/100 g腹腔注射相應藥物，每日1次，連續3 d[8];正常組和模型組小鼠按1 mL/100 g灌胃生理鹽水，每日1次，連續7 d。第7天給藥后，除正常組外，其余各組小鼠均于鼻內單次滴注LPS 5 mg/kg（滴注時間5 min）以建立ALI模型[9]。

2.2 肺泡灌洗液中的中性粒細胞凋亡情況考察

ALI模型復制24 h后，麻醉小鼠，分離其氣管，將導管插入支氣管，注入0.5 mL生理鹽水灌洗，并反復抽吸灌洗液，重復灌洗5次;收集灌洗液，以250×g離心10 min，棄去上清液，沉淀加磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.2～7.4）1 mL，輕柔吹打、重懸，吸取上述細胞懸液（細胞計數約為1×105個/L）20 μL至載玻片上，以固定液（甲醇-冰乙酸，體積比3 ∶ 1）處理15 min后，用Hoechst 33242染色液于室溫避光條件下染色15 min，置于激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察。每個樣本選擇500個細胞進行觀察，記錄中性粒細胞的凋亡情況（凋亡細胞細胞核呈亮藍色，正常細胞細胞核呈淡藍色）。另取上述細胞懸液100? ? ?μL，加入Annexin Ⅴ-FITC和PI染色試劑各5 μL，于室溫避光條件下染色20 min，使用流式細胞儀檢測中性粒細胞的凋亡率（FITC熒光波長設為530 nm，PI波長設為560 nm;FL1通道檢測綠色熒光，FL3檢測紅色熒光）。以上試驗重復3次。

2.3 血漿中IL-6、TNF-α含量檢測

在灌洗前，于小鼠腹主動脈取血1 mL，置于肝素抗凝采血管中，搖勻，以1 000×g離心3 min，分離血漿。采用ELISA法以酶標儀檢測各組小鼠血漿中IL-6、TNF-α的含量，嚴格按照相應試劑盒說明書操作。

2.4 肺濕質量/干質量比值檢測

取血后，采用頸椎脫臼法處死各組小鼠，取其右肺上葉，稱定濕質量（W）;于80 ℃恒溫干燥箱中烘烤約48 h至恒定質量，記為干質量（D）;計算各組小鼠肺濕質量/干質量（W/D）比值。

2.5 肺組織形態學觀察

采用HE染色法觀察。稱定肺質量后，取小鼠肺組織適量，置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，經常規石蠟包埋、切片（厚度約1～2 μm）后，以HE染色，并置于光學顯微鏡下觀察肺組織的形態學特征。

2.6 肺組織中TLR4、NF-κB蛋白相對表達量檢測

采用Western blotting法檢測。取小鼠肺組織適量，用蛋白提取試劑盒提取肺組織蛋白，使用BCA法測定蛋白含量。煮沸10 min使蛋白變性，于4 ℃以12 000×g離心3 min，取沉淀進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）[恒流（10 mA）至分離膠后改為恒壓（100 V）]。電泳結束后，轉膜，加入相應一抗（稀釋度均為1 ∶ 1 000），加BSA 2 mL，于4 ℃孵育過夜，用三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（TBST）溶液清洗10 min×5次;加入相應二抗（稀釋度均為1 ∶ 1 000），室溫孵育1 h，用TBST溶液洗滌10 min×5次。經ECL化學發光顯色液顯色后，置于凝膠成像系統中成像，使用Image Pro-plus 6.0軟件分析。以相應蛋白與內參（β-actin）的灰度值比值表示該蛋白的相對表達量。以上試驗重復3次。

2.7 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件對數據進行統計分析。計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK法。P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 Res對ALI模型小鼠肺泡灌洗液中的中性粒細胞凋亡的影響

正常組小鼠肺泡灌洗液中的中性粒細胞呈淺藍色，凋亡細胞較少;模型組小鼠肺泡灌洗液中可見明顯亮藍色凋亡中性粒細胞，并可見細胞核固縮、碎裂等現象，且其凋亡率較正常組顯著升高（P<0.01）;各給藥組小鼠肺泡灌洗液中凋亡中性粒細胞明顯增多，且凋亡率均較模型組顯著升高（P<0.05或P<0.01），詳見圖1（圖中，粗箭頭表示正常細胞，細箭頭表示凋亡細胞）、圖2、表1。

3.2 Res對ALI模型小鼠血漿中IL-6、TNF-α含量的影響

與正常組比較，模型組小鼠血漿中IL-6、TNF-α含量均顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，各給藥組上述指標含量均顯著降低（P<0.05或P<0.01），詳見表2。

3.3 Res對ALI模型小鼠肺W/D比值的影響

與正常組比較，模型組小鼠肺W/D比值顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，各給藥組小鼠肺W/D比值均顯著降低（P<0.05或P<0.01），詳見表3。

3.4 Res對ALI模型小鼠肺組織形態學特征的影響

正常組小鼠肺組織結構完整，肺泡腔干凈，肺泡壁無增厚、水腫、充血、液體滲出及其他炎癥表現，也未見炎癥細胞浸潤。模型組小鼠肺組織呈暗紅色，水腫、充血明顯，且有片狀出血和少許液體滲出，部分肺葉甚至可見紅色實變區。Res低劑量組小鼠肺組織可見有斑片狀出血點，范圍和程度均較模型組小或輕;陽性對照組和Res中、高劑量組小鼠肺組織出血點較少，水腫現象不明顯，滲出程度均較模型組輕，詳見圖3。

3.5 Res對ALI模型小鼠肺組織TLR4、NF-κB蛋白表達的影響

與正常組比較，模型組小鼠肺組織中TLR4、NF-κB蛋白的相對表達量均顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，陽性對照組和Res中、高劑量組小鼠肺組織中TLR4、NF-κB蛋白的相對表達量均顯著降低（P<0.05或P<0.01），詳見圖4、表4。

4 討論

有研究指出，Res能減輕LPS誘導的牙周膜細胞損傷并抑制TLR4/NF-κB活化，也可通過TLR4/NF-κB通路減輕缺氧復氧誘導的肝細胞損傷，其干預小鼠的劑量以30、100、400 mg/kg不等，給藥方式包括腹腔注射、股靜脈注射、灌胃等[10]。結合現有研究的數據[7，11-12]和本課題組前期預實驗結果，本研究采用Res 50、100、200 mg/kg以灌胃的方式進行干預;同時，為確保小鼠體內Res達到穩態濃度，本研究采用了造模前連續灌胃方式。地塞米松為經典激素類抗炎藥物，故本研究以該藥作為Res抗炎作用陽性對照藥物。由于腹腔注射藥物吸收快，因此地塞米松選擇腹腔注射，每日1次，連續3 d;Res的半衰期為9.2 h，達穩態濃度時間需要4～5個半衰期，且口服吸收較慢，因此本研究選擇Res的持續灌胃時間為7 d[8，13]。盡管陽性對照組和Res組小鼠的給藥方式和持續時間有所不同，但最后藥物在體內發揮的效應相似（考察指標數據結果相近），加之本研究以比較Res抗炎作用是否與地塞米松相近為重點，故設定了“2.1”項下的給藥方式。

目前，ALI模型可分為肺內型和肺外型兩大類[13-14]，主要包括盲腸結扎穿孔、生理鹽水肺灌注、鼻內滴注LPS等，以肺W/D比值以及肺組織病理改變等為指標對肺部病變情況進行判定[15-16]。本研究的主要目的在于觀察ALI形成后，Res是否能通過影響炎癥因子表達而發揮作用，對氧合指數以及是否發展為急性呼吸窘迫綜合征等不作研究，因此綜合各方法的優缺點最終選擇鼻內滴注LPS造模。本研究結果顯示，模型組小鼠肺W/D比值顯著升高，提示肺部水腫嚴重;病理切片顯示小鼠肺組織充血明顯，肺泡腔內可見出血和滲出，甚至可見紅色突變區，提示肺組織呈現急性炎癥表現，證實ALI炎癥模型建立成功。

中性粒細胞凋亡在ALI的發生發展過程中起著重要作用。ALI患者肺部急性炎癥癥狀明顯，出現大量聚集的中性粒細胞[17]。中性粒細胞在正常生理條件下壽命極短，在外周血循環中半衰期為2～8 h;在ALI發生24 h后，肺泡灌注液中的中性粒細胞凋亡率明顯上升[18]。然而，盡管中性粒細胞凋亡率明顯上升，但其聚集數量仍明顯多于正常時期，從而導致了肺部嚴重炎癥反應的發生。由此可見，若能采用恰當的手段減少肺組織中的中性粒細胞，就能夠有效減少致炎因子和炎癥介質的釋放，從而有效改善肺部炎癥癥狀[19]。Hoechst 33342染色結果和流式細胞結果顯示，模型組小鼠由于LPS的刺激，肺泡灌洗液中凋亡中性粒細胞明顯增多，且凋亡率較正常組顯著升高;經Res預處理后，小鼠肺泡灌洗液中的中性粒細胞凋亡率均較模型組顯著上升。這提示在抗炎過程中，Res能較模型組進一步促進中性粒細胞的凋亡，從而減少中性粒細胞的聚集。

TLR4信號通路參與了機體炎癥反應，MyD88依賴的TLR4途徑可促炎癥因子的產生，從而激活NF-κB，后者可進一步釋放炎癥因子，從而引發“瀑布效應”導致全身炎癥反應的發生[5]。其中，IL-6是IL家族的核心成員，在B細胞分化、T細胞增殖、急性期反應蛋白誘導等方面發揮著重要的作用，是反映機體炎癥和疾病嚴重程度的指標之一[20];TNF-α不僅對損傷細胞具有直接毒性，還能通過結合多種細胞和活性物質間接對組織造成進一步損傷[21]。有研究指出，在ALI發生初期（2 h），肺組織中即可產生TNF-α，且隨著時間的推移，最快6 h、最慢24 h后TNF-α含量即可達到最大值[22-23]。由此可見，IL-6和TNF-α參與了ALI早期嚴重炎癥的發生。TLR4作為LPS的特異性配體，參與了LPS致ALI的發病過程，TLR4通路下游的NF-κB被激活后，導致炎癥因子分泌進一步增多，提示TLR4與NF-κB參與了ALI的發展過程[24]。本研究結果顯示，由于LPS的刺激，模型組小鼠血漿中IL-6、TNF-α含量均顯著升高，肺組織中TLR4、NF-κB蛋白的相對表達量均顯著升高，提示模型組小鼠的炎癥反應可能與TLR4信號通路的激活有關。經Res預處理后，小鼠血漿中IL-6、TNF-α含量以及肺組織中TLR4、NF-κB蛋白的相對表達量均顯著降低，提示Res能夠抑制TLR4的表達，并進一步抑制NF-κB的激活，從而減少炎癥因子的表達，最終減輕ALI程度。

綜上所述，Res對ALI模型小鼠具有一定的保護作用，其作用機制可能與抑制TLR4、NF-κB表達、從而減少炎癥因子TNF-α、IL-6分泌有關，但具體的分子機制還有待后續深入研究。

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（收稿日期：2019-08-11 修回日期：2020-02-06）

（編輯：張元媛）