克里本類芽孢桿菌抗水稻稻瘟病初探

肖 娜 張秋英 龍 偉

（1.吉安職業技術學院，江西吉安 343000；2.江西省吉安市農業農村局，江西吉安 343000）

在全世界范圍內，水稻病害主要有3 種類型：稻瘟病、白葉枯病及紋枯病[1-3]。其中，稻瘟病又被“譽為”水稻3 大病害之首，是由子囊菌Magnaporthe grisea （Hebert）Barr稻梨孢屬真菌引起的水稻真菌性病[4-5]。對于稻瘟病的防治目前還沒有強有力的措施，通常主要從栽培管理、抗病品種選育、化學防治、生物防治等方面對稻瘟病進行綜合防治[6-8]。克里本類芽孢桿菌（Paenibacillus kribbensis）屬于原核生物界，厚壁菌門，桿菌綱，芽孢桿菌目，芽孢桿菌科，類芽孢桿菌屬。近年來，人們逐漸發現克里本類芽孢桿菌具有較好的抗真菌活性，已有相關學者在對其進行深入研究[9-12]。本文先研究這兩種菌在不同培養基的生長情況，選擇一種合適的培養基做培養基對峙實驗，在水稻上噴灑稻瘟病菌孢子懸浮液和克里本類芽孢桿菌菌株發酵液，同時觀測水稻發病情況，研究克里本類芽孢桿菌對水稻稻瘟病是否有抑制作用。所得到實驗能給水稻稻瘟病的生物治療提供一個新的方向。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與設備 實驗供試菌株：江西天人股份有限公司保存的克里本類芽孢桿菌菌株，江西農業大學保存的稻瘟病菌菌株，水稻由井岡山應用科技學校提供。

供試培養基：固體PDA 培養基（PDA 8 g、瓊脂2 g）；固體察氏培養基（蔗糖6 g、硝酸鈉0.3 g、磷酸氫二鉀0.2 g、硫酸鎂0.1 g、氯化鉀0.1 g、硫酸鐵0.002 g、瓊脂4 g）；固體牛肉浸膏蛋白胨培養基（牛肉浸膏1 g、蛋白胨2 g、氯化鈉1 g、瓊脂4 g）；液體PDA 培養基（PDA 8 g）；液體察氏培養基（蔗糖6 g、硝酸鈉0.3 g、磷酸氫二鉀0.2 g、硫酸鎂0.1 g、氯化鉀0.1 g、硫酸鐵0.002 g）。YXQSG46-280S 高壓滅菌鍋由上海東亞壓力容器制造有限公司生產，DHP-9082MBE 電熱恒溫培養箱由常州市人和儀器廠生產。SW-CJ-2D 雙人超凈工作臺由蘇州蘇潔凈化設備有限公司生產。

1.2 實驗方法

1.2.1 不同培養基對克里本類芽孢桿菌和稻瘟病菌的生長影響 ①將供試克里本類芽孢桿菌菌株分別接種至固體PDA 培養基、固體察氏培養基、固體牛肉浸膏蛋白胨培養基3 種培養基上，并在37℃恒溫培養箱中培養48 h，觀察并記錄菌株生長性狀。②將供試稻瘟病菌菌株菌絲體分別接種上述3 種培養基上，在30℃恒溫培養箱中培養48 h，觀察并記錄菌株生長性狀。

1.2.2 克里本芽孢桿菌和稻瘟病菌對峙實驗 將克里本類芽孢桿菌用劃線法接在察氏培養基的一半，再將稻瘟病用劃線法接到另一半培養基，在37℃恒溫培養箱中48 h 后觀察兩種菌的生長情況。

1.2.3 克里本類芽孢桿菌對水稻盆栽稻瘟病菌的抑制 稻瘟病菌孢子懸浮液的制備方法如下。將已純培養的供試稻瘟病菌菌株接種到斜面培養基上，待菌絲長滿后加入1.5 mL 的滅菌水并輕輕刮菌絲，后移取菌絲液到盛有PDA 培養基的培養皿（9 cm）上，涂布均勻后放置在28℃恒溫箱中培養。待平板上菌絲長滿后（約7 d），在無菌條件下刮除平板上菌絲后置于室內組織培養架上光照培養24 h，室溫維持在25℃～28℃。等到充分產孢（約5 d）后，每皿用5 mL 蒸餾水洗下孢子，對孢子濃度進行濃縮，在100 倍顯微鏡下計數孢子數量，最后用血球計數板調節孢子濃度至5×103個/mL，制備稻瘟病菌孢子懸浮液。

克里本類芽孢桿菌菌株發酵液的制備方法如下。將克里本類芽孢桿菌活化后，挑取單菌或菌落接種到液體察氏培養基中，經過30℃震蕩培養84 h 后得克里本類芽孢桿菌菌株發酵液，對克里本類芽孢桿菌菌株發酵液進行濃縮，最后用血球計數板在100 倍顯微鏡下計數菌株數量。選用品種為欣榮優08，按照水稻盆實驗方法浸種、催芽后，待胚根長至2 cm左右，選擇兩株長勢一致的水稻苗移栽至塑料放盤中土培，長至3 葉期，一株水稻噴灑稻瘟病菌孢子懸浮液和克里本類芽孢桿菌菌株發酵液，另一株則作為空白對照組，不噴灑克里本類芽孢桿菌菌株發酵液，同時觀測水稻發病情況。

2 結果與討論

2.1 不同培養基對克里本類芽孢桿菌的影響 克里本類芽孢桿菌菌株在不同培養基上，生長性狀有明顯的差異，菌落形態較為相似。在察氏培養基和牛肉浸膏蛋白胨培養基上，克里本類芽孢桿菌菌落呈乳白色、膿狀、近圓形、邊緣整齊、菌落隆起，表面黏稠；在PDA 培養基上，克里本類芽孢桿菌不生長。由此可見，在上述3 種培養基中，PDA 培養基沒有菌株生長，不適合克里本類芽孢桿菌生長，而察氏培養基和牛肉浸膏蛋白胨培養較適合克里本類芽孢桿菌生長，其中以察氏培養基最適合，如圖1、圖2、圖3 所示。每次實驗設置3 個平行。

圖1 察氏培養基培養的克里本類芽孢桿菌

圖2 牛肉浸膏蛋白胨培養基培養的克里本類芽孢桿菌

圖3 PDA 培養的克里本類芽孢桿菌

2.2 不同培養基對稻瘟病菌的影響 稻瘟病菌菌株在不同培養基上，生長性狀有明顯的差異，菌落形態較為相似。稻瘟病菌菌株在PDA 培養基上生長較快，早期為灰色半透明，24 h 后轉為灰色有黑色輪紋，菌落底面黑色，培養基不變色。在察氏培養基上菌株生長較快，早期菌絲層薄半透明，48 h 后菌絲由白色變為灰色，菌絲層較為疏松，菌落表面灰色，底面黑色，培養基不變色。在牛肉膏蛋白胨培養基上菌株生長最慢，但菌絲致密，菌絲層厚，菌落表面白色，菌落邊緣培養基變為黃褐色。由此可見，PDA 培養基、察氏培養基和牛肉膏蛋白胨培養基都適合稻瘟病菌生長，如圖4、圖5、圖6 所示。

圖4 PDA 培養基培養的稻瘟圖

圖5 察氏培養基培養的稻瘟病菌

圖6 牛肉浸膏蛋白胨培養基培養的稻瘟病菌

2.3 克里本芽孢桿菌和稻瘟病菌對峙實驗 將克里本類芽孢桿菌用劃線法接在察氏培養基的一半，再將稻瘟病用劃線法接到另一半，放在37℃恒溫培養箱中72 h 后觀察結果，發現克里本類芽孢桿菌能對稻瘟病菌產生抑菌效果,如圖7 所示。

圖7 克里本芽孢桿菌和稻瘟病菌對峙實驗

2.4 克里本類芽孢桿菌對水稻盆栽稻瘟病的影響 試驗表明，空白對照組的葉片病斑呈梭形或紡錘形，長1 ～1.5 cm，寬0.3 ～0.5 cm，病斑中央呈灰白色，邊緣褐色，外圍常有淡黃色暈圈，病斑兩端有向葉脈延伸的褐色壞死線，背面生有灰色霉層。病斑多時互相連接形成不規則大斑，一些葉片逐漸枯死；而經過克里本類芽孢桿菌的無菌發酵液處理的葉片沒有出現，葉片呈梭形或紡錘形，中央呈灰白色，邊緣褐色，外圍常有淡黃色暈圈的病斑，且葉片仍然保持綠色，表現出良好的抑菌活性。由此可見，克里本類芽孢桿菌對水稻稻瘟病有抑制作用如圖8、圖9、圖10、圖11 所示。

圖8 稻瘟病水稻

圖9 稻瘟病水稻葉子

圖10 稻瘟病-克里本水稻

圖11 稻瘟病-克里本水稻葉子

3 結語

PDA 培養基、察氏培養基和牛肉膏蛋白胨培養基都適合稻瘟病菌生長；PDA 培養基不適宜克里本類芽孢桿菌生長，察氏培養基和牛肉浸膏蛋白胨為主的培養基較適宜克里本類芽孢桿菌生長。將克里本類芽孢桿菌和稻瘟病菌同時接種到察氏培養基上，發現克里本類芽孢桿菌能對稻瘟病菌產生一定的抑菌效果。只噴灑稻瘟病菌包子懸濁液的水稻盆栽出現稻瘟病，而噴灑了稻瘟病菌孢子懸濁液和克里本類芽孢桿菌菌株發酵液的水稻盆栽無明顯變化，表明克里本類芽孢桿菌對水稻稻瘟病有良好的抑制作用。所得到的結果可以為克里本類芽孢桿菌抗水稻稻瘟病研究提供一定的實驗依據，同時為治療水稻稻瘟病提供一定的理論依據，具有重要的意義。