溫州市食源性彎曲菌耐藥特征與分子分型研究

章樂怡，樓輝煌，胡玉琴，王黎荔，繆蔚蔚，李 毅，吳躍進

彎曲菌(Campylobacter)是人獸共患病原菌，也是主要的食源性病原菌。導致人類彎曲菌病的彎曲菌屬主要菌種是空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌(90%以上)[1]。空腸彎曲菌的自然宿主主要是禽類和鳥類，也可從豬、牛等哺乳動物中分離到[2]，家禽通常被認為是人類感染彎曲菌病的最常見來源[3]。處理或食用生肉或未煮熟的肉類產(chǎn)品，通常會導致疾病[4]。人感染后可引起彎曲菌病，主要癥狀為腹瀉性腸炎，以腹瀉、腹痛和發(fā)燒為主，雖然空腸彎曲菌感染多為自限性疾病，但20%以上的患者會出現(xiàn)病情反復(fù)或病程延長現(xiàn)象，嚴重者會并發(fā)吉蘭-巴雷綜合征(guillain-barré syndrome，GBS)[5]。2007年在中國吉林曾發(fā)生空腸彎曲菌疫情，有32例被確認為GBS患者[6]。彎曲菌引起的腸炎被認為是發(fā)達國家及發(fā)展中國家最常見的細菌性腸炎之一，在歐美等國家，報道最多的食源性疾病是彎曲菌病，其發(fā)病率已超過了沙門菌、志賀菌以及李斯特菌[7]。美國每年約有150萬人次患彎曲菌病，而且多達40%的吉蘭-巴雷綜合征病例可能是彎曲菌感染引起[8]。在耐藥方面，近年來不同來源的彎曲菌的耐藥性在明顯增強[9-10]。2016年歐盟抗生素耐藥性數(shù)據(jù)顯示，從人類和雞中分離的彎曲菌對環(huán)丙沙星和四環(huán)素耐藥性呈上升趨勢，有些達到極高的耐藥性[11]。2013年，美國CDC將耐氟喹諾酮類和大環(huán)內(nèi)酯類彎曲菌列為影響公共衛(wèi)生的耐藥威脅之一[12]。印度的文獻報道顯示，從腹瀉病人中分離到的菌株對萘啶酸耐藥率為100%，對環(huán)丙沙星的耐藥率為86.66%，耐3 種或3 種以上抗生素的菌株占41.66%[13]。我國文獻報道234 株空腸彎曲菌中萘啶酸耐藥率為93.16%，環(huán)丙沙星耐藥率為90.17%[14]。

故在本市進行彎曲菌病例監(jiān)測，了解溫州市食源性疾病彎曲菌感染現(xiàn)狀，獲得彎曲菌分離株的耐藥特征，建立本地彎曲菌分子分型數(shù)據(jù)庫，對溫州市預(yù)防和控制彎曲菌病的發(fā)生和發(fā)展及對彎曲菌病的防治提供新思路及科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1腹瀉病例調(diào)查 在2017年11月至2019年7月期間，對溫州市2所食源性疾病監(jiān)測哨點醫(yī)院主動就診的符合食源性疾病腹瀉病例定義的患者進行個案調(diào)查和采樣。兩所哨點醫(yī)院包括1所市本級的三甲醫(yī)院和1所縣區(qū)級的二乙醫(yī)院。采集糞便標本送至本中心的實驗室進行彎曲菌檢測。

1.2主要儀器與試劑 Mastercycler○Rep gradient S梯度PCR儀為德國艾本德產(chǎn)品；Qsep100全自動核酸蛋白分析系統(tǒng)-毛細管電泳儀購自臺灣BIOptic(光鼎)公司；雙孔濾膜法彎曲菌培養(yǎng)基(ZC-CAMPY-001)、彎曲菌六重PCR試劑盒(ZC-CAMPY-004)、彎曲菌瓊脂稀釋法抗生素最低抑菌濃度(MIC)檢測試劑盒(ZC-AST-001)購自青島中創(chuàng)生物科技有限公司；MLST 7個管家基因由杭州擎科生物科技有限公司合成。

1.3 實驗室檢測

1.3.1彎曲菌分離培養(yǎng) 本研究采用濾膜法分離空腸彎曲菌[15]。挑取適量糞便標本放入彎曲菌促生長增菌液中增菌后，取300 μL轉(zhuǎn)入雙孔濾膜板濾膜上，兩塊濾膜分別置于哥倫比亞血平板和 Karmali平板上，微需氧條件下42 ℃微需氧環(huán)境下培養(yǎng)48 h，鏡檢形態(tài)為G-、弧形、S形或螺旋形等可疑菌落分純后進一步進行生化鑒定。生化鑒定參照 GB 4789.9-2014[16]進行試驗。

1.3.2PCR分型鑒定 采用彎曲菌六重PCR法檢測試劑盒進行彎曲菌分型。通過多重PCR核酸檢測的方法，針對彎曲菌屬、種特異性基因核酸片段進行擴增。用于檢測彎曲桿菌屬、空腸彎曲菌、結(jié)腸彎曲菌、胎兒彎曲菌、紅嘴鴨彎曲菌和烏普薩拉彎曲菌，他們的目標基因分別是16s rRNA、MapA、glyA-C.coli、sapB2、glyA-C.lari和cdtB，目的片段分別為816 bp、589 bp、126 bp、435 bp、251 bp和342 bp。PCR循環(huán)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 1 min、55 ℃ 1 min、72 ℃ 2 min，循環(huán)35次，72 ℃延伸5 min，擴增后用Qsep100全自動核酸蛋白分析系統(tǒng)-毛細管電泳儀對條帶進行分析。

1.3.3MLST 分子分型 利用7 個管家基因?qū)漳c彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌進行分子分型。彎曲菌7 個管家基因包括aspA、glnA、gltA、glyA、pgm、tkt和uncA，擴增引物、測序引物及擴增條件參照MLST 數(shù)據(jù)庫(http: //pubmlst．org /campylobacter/)，反應(yīng)程序為 94 ℃ 5 min 預(yù)變性，隨后94 ℃ 30 s，50 ℃退火 30 s，72 ℃延伸45 s，共35 個循環(huán)。擴增產(chǎn)物由杭州擎科生物科技有限公司進行測序，將測序結(jié)果上傳到 MLST 數(shù)據(jù)庫獲取每個菌株7 個管家基因的等位基因編號，根據(jù)等位基因編號確定ST型及克隆群(clonalcomplex，CC)。與數(shù)據(jù)庫比對后數(shù)據(jù)庫中沒有的ST型則為新發(fā)現(xiàn)的ST型。最后根據(jù)已獲得的ST型使用BioNumeric軟件進行聚類，生成空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌的最小生成樹。

1.3.4藥敏試驗 根據(jù)CLSI推薦的彎曲菌瓊脂稀釋法(Agar Dilution Method)對菌株進行藥敏試驗，采用商品化的彎曲菌瓊脂稀釋法檢測盒進行試驗。抗菌藥物包含了7大類11種，具體為大環(huán)內(nèi)酯類：紅霉素(Erythromycin，ERY)、阿奇霉素(Azithromycin，AZI)；氨基糖苷類：慶大霉素(Gentamicin，GEN)、鏈霉素(Streptomycin，STR)；氯霉素類：氯霉素(Chloramphenicol，CHL)、氟苯尼考(Florfenicol，F(xiàn)LO)；喹諾酮類及氟喹諾酮類：萘啶酸(Nalidixic acid，NAL)、環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin，CIP)；四環(huán)素類：四環(huán)素(Tetracycline，TET)；林可酰胺類：克林霉素(Clindamycin，CLI)；酮內(nèi)酯類：泰利霉素(Telithromycin，TEL)。空腸彎曲菌ATCC33560作為質(zhì)控菌株。42 ℃微需氧培養(yǎng)48 h后讀結(jié)果。記錄彎曲菌對各類藥物的最低抑菌濃度值(MIC值)，根據(jù)美國NARMS(National Antimicrobial Resistance Monitoring System)標準(https://www.cdc.gov/narms/antibiotics-tested.html)及文獻報道對彎曲菌的耐藥性進行判定[17]。

1.4統(tǒng)計分析 使用SPSS20.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料的比較應(yīng)用卡方檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1流行病學分析 對2017年11月至2019月7月間食源性疾病病例定義患者樣本進行了彎曲菌檢測，其中男性509 例，女性400 例，年齡為1月齡～91歲。彎曲菌病例調(diào)查顯示，患者均有不同程度的腹瀉，以水樣便居多，2 例黏液便，1 例膿血便，腹瀉次數(shù)3～20 次不等，5 例伴發(fā)熱(體溫37.5～39.3 ℃)，3 例伴嘔吐。彎曲菌的總陽性率為10.2%(93/909)，2018、2019年陽性率分別為 11.5%、9.0%，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=1.37,P>0.05)。其中空腸彎曲菌陽性率為8.9%(81/909)，結(jié)腸彎曲菌陽性率為1.3%(12/909)，二者差異有統(tǒng)計學意義(χ2=53.954,P<0.05)，見表1。按年齡分為6 個組,分別為0～14 歲組、15～30 歲組、31～45 歲組、46～60 歲組、61～75 歲組和76～91 歲組。各年齡組間陽性率差異無統(tǒng)計學意義(χ2=2.09,P>0.05)，見表2。按季節(jié)統(tǒng)計，每個季節(jié)均檢出彎曲菌，春季(3-5月)陽性率為10.5%(31/295)、夏季(6-8月)陽性率為8.6%(15/175)、秋季(9-11月)陽性率為9.9%(10/101)，冬季(12-次年2月)陽性率為11.0%(37/337)。不同季節(jié)彎曲菌陽性率差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.468,P>0.05)。

表1 溫州市食源性疾病患者不同年份彎曲菌檢出情況Tab.1 Detection of Campylobacter in foodborne patients in different years in Wenzhou

表2 溫州市食源性疾病患者不同年齡彎曲菌檢出情況Tab.2 Detection of Campylobacter in foodborne patients in different ages in Wenzhou

2.2彎曲菌分離株的耐藥情況 本研究共對93 株腹瀉病人中檢出的彎曲菌進行了藥敏試驗，對7大類11種抗生素的耐藥率結(jié)果見表3，其中空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌多重耐藥率(耐3種以上抗生素)分別為42.0%(34/81)、50.0%(6/12)。空腸彎曲菌與結(jié)腸彎曲菌多重耐藥率差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.275，P>0.05)。空腸彎曲菌對萘啶酸、環(huán)丙沙星和四環(huán)素的耐藥率分別為93.8%(76/81)、92.6%(75/81)、85.2%(69/81),結(jié)腸彎曲菌對萘啶酸、環(huán)丙沙星和四環(huán)素的耐藥率分別為91.7%(11/12)、100%、100%。

93 株彎曲菌對11 種抗菌藥物共產(chǎn)生了22 種耐藥譜，對11 種藥全耐的1 株菌為結(jié)腸彎曲菌，耐NAL-CIP-TET譜型的最多，占38.7%(36/93)，耐NAL-CIP-TET-FLO譜型的占21.5%(20/93)。NAL-CIP-TET和NAL-CIP-GEN-TET是空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌共有的耐藥譜型。見圖1。

表3 93株彎曲菌分離株對11種抗菌藥物的耐藥率Tab.3 Drug resistance rate of 93 Campylobacter isolates against 11 antimicrobial agents

圖1 93株彎曲菌分離株對11種抗菌藥物的耐藥譜Fig.1 Resistance of 93 Campylobacter isolates against 11 antimicrobial agents

2.3彎曲菌分離株MLST分子分型檢測 93株彎曲菌分離株中，空腸彎曲菌被分成54 種ST型，其中32 種ST型歸為15 種克隆群(Clonal Complex，CC)，未歸類的ST型為22 種，其中新發(fā)現(xiàn)的ST型為14 種。構(gòu)成比最高的CC為ST45CC，占11.1%(9/81)，其次是ST464CC、ST21CC，分別占9.8%(8/81)、8.6%(7/81)，最多的ST型為ST3578，為5株，其次是ST137、ST464、ST6607，均為4 株。

12 株結(jié)腸彎曲菌包含8 種ST型，其中6 種ST型歸為同一克隆群ST828CC，共包含了10 株，一種ST型未被分配克隆群。新發(fā)現(xiàn)的ST型為2 種。見圖2。

注：在最小生成樹中，圓圈周圍的數(shù)字代表彎曲菌MLST型別，圓圈的大小表示這個ST型的分離株數(shù)量。帶*號ST型的表示是數(shù)據(jù)庫中沒有本研究新發(fā)現(xiàn)的ST型。紅色圓圈代表結(jié)腸彎曲菌，藍色圓圈代表空腸彎曲菌。圖2 93株彎曲菌分離株的最小生成樹Fig.2 Minimum spanning tree of 93 Campylobacter isolates

3 討 論

近年來彎曲菌感染已經(jīng)成為發(fā)達國家細菌性食源性疾病的主要原因，食源性彎曲菌感染的數(shù)量已超過沙門菌。 隨著我國各地空腸彎曲菌感染呈上升趨勢，陸續(xù)有聚集暴發(fā)病例出現(xiàn)，彎曲菌也慢慢成為我國最重要的腹瀉病原菌之一。本研究對溫州市區(qū)兩家醫(yī)院的腹瀉病人進行彎曲菌的監(jiān)測分析并對菌株進行多位點序列分型和藥敏試驗。909例的病例監(jiān)測結(jié)果表明溫州市彎曲菌陽性率為10.23%，高于同一時期溫州市兩家監(jiān)測點醫(yī)院食源性沙門菌的陽性率0.9%(18/1 909)(χ2=140.396，P<0.05 )；與食源性副溶血弧菌的陽性率8.1%(155/1 909)差異無統(tǒng)計學意義(χ2=3.421，P>0.05)，也高于上海腹瀉病例彎曲菌陽性率5.02%[18]和河南腹瀉病例彎曲菌檢出率6.3%[19]。結(jié)合流行病學顯示溫州市彎曲菌感染的食源性病例中不同年齡段的陽性率無統(tǒng)計學差異，不同季節(jié)的陽性率也無明顯差異。與其他報道彎曲菌夏秋季檢出為主、且空腸彎曲菌腸炎患者以嬰幼兒多見(50%)有所不同[19]。但本研究中病人中空腸彎曲菌檢出率(8.9%)明顯高于結(jié)腸彎曲菌(1.3%)，同北京、上海的報道一致[15，18]。有報道過濾富集法是從腹瀉患者糞便標本中分離彎曲菌最有效的方法，濾膜法檢出率高于傳統(tǒng)的Karmali 選擇性平板[20]，因而本文采取了經(jīng)增菌的濾膜法，檢出率得到大幅度地提高。

文獻報道彎曲菌對喹諾酮類、四環(huán)素類抗生素的耐藥率表現(xiàn)很高的耐藥性[14，21]。本研究藥敏試驗結(jié)果也證實了這個結(jié)論，分離菌株表現(xiàn)出耐藥譜型的多樣性，共產(chǎn)生了22種耐藥譜，以萘啶酸-環(huán)丙沙星-四環(huán)素耐藥譜型為優(yōu)勢耐藥譜，對這3種藥物的耐藥率分別達到93.5%、93.5%、87.1%。空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌多重耐藥率分別為 42.0%、50.0%。結(jié)腸彎曲菌對大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類耐藥率均高于空腸彎曲菌(χ2=21.594，P<0.05)、(χ2=23.357，P<0.05)，其中結(jié)腸彎曲菌對大環(huán)內(nèi)酯類的耐藥率均達到33.3%以上，而空腸彎曲菌對這兩大類的耐藥率均低于10%。33.3%的結(jié)腸彎曲菌分離株對9種以上的藥物耐藥，1株菌對11種藥物全部耐藥。而北京和上海的腹瀉病例中結(jié)腸彎曲菌的紅霉素、鏈霉素、慶大霉素的耐藥率更高，分別達到61%、72%、59%[22]。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素是目前臨床推薦治療彎曲菌感染的一線用藥，而結(jié)腸彎曲菌的多重耐藥已經(jīng)不可忽視，對大環(huán)內(nèi)酯類的高耐藥率將給臨床治療帶來新的考驗。人源彎曲菌的耐藥現(xiàn)狀可能與抗生素在臨床和獸醫(yī)藥中的使用不規(guī)范有關(guān)[23]。

多位點序列分型方法具有高分辨率、重復(fù)性好，且能實現(xiàn)數(shù)據(jù)全球共享。本研究結(jié)果顯示，溫州市彎曲菌菌株總體呈現(xiàn)遺傳多態(tài)性、多個克隆株共存的現(xiàn)象。不同彎曲菌呈現(xiàn)不同的基因特征，空腸彎曲菌與結(jié)腸彎曲菌遺傳關(guān)系相差甚遠。空腸彎曲菌呈復(fù)雜的遺傳多樣化，93株彎曲菌分離株分為54 種ST型，中間包含了15種克隆復(fù)合物。而結(jié)腸彎曲菌分離株遺傳變異上相對保守，83.3%(10/12)屬于ST828CC，這與文獻[22]報道(86%)一致。結(jié)腸彎曲菌中發(fā)現(xiàn)一株ST1121，在國內(nèi)文獻中較少見，在數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)荷蘭和英國均提交過這個ST型的病人株。空腸彎曲菌ST45已經(jīng)被認為與人類神經(jīng)系統(tǒng)疾病(GBS)有關(guān)[24]，在我們的研究中病人株ST45CC是占比最多的，其中就有ST45。數(shù)據(jù)庫中顯示屬于ST45CC中的ST137、ST45來源于各種宿主，如人、禽肉、狗、羊、鳥、環(huán)境水中均有,說明這個克隆群有廣泛的宿主范圍，并且對環(huán)境適應(yīng)良好。空腸彎曲菌ST464 曾是北京某區(qū)2016-2017年腹瀉病例中分離空腸彎曲菌的優(yōu)勢 ST 型[20]，而在本研究中ST464CC也是僅次于ST45CC的一個克隆群，其中ST464也占了4株。本研究提交了16種新ST型別，豐富了全球彎曲菌數(shù)據(jù)庫，其中7種新的ST型與其他分離株親緣關(guān)系較遠，另9種均可以在我們本地分離株中找到相同的克隆群。

通過聚類分析我們經(jīng)常發(fā)現(xiàn)相同 ST 的菌株，相同 ST 型往往被認為是同一克隆菌株感染，提示有聚集性病例的可能。在本研究中都是散發(fā)病例，但這種方法的建立將有利于研究今后本地區(qū)的聚集性食源性疾病的溯源。

利益沖突：無