澳門地區雞源性產超廣譜β-內酰胺酶大腸埃希菌基因型檢測

李婉芬, 王 璐, 謝詠琳, 方 琳, 毛文慧, 林倩琦, 林健邦, 王寶珍

大腸埃希菌是一種在腸道分布廣泛的細菌亦是條件致病菌，大部分類型對人體無害，但有些型可致病，若人體內的大腸埃希菌含有耐藥基因，可在腸道內轉移到人類已適應的細菌或病原體中，這會延長疾病的時間和增加相關治療的失敗率。近年來，食用動物特別是肉雞和水源的細菌中分離出大腸埃希菌菌株數量有上升趨勢[1]。故本研究對澳門地區市售雞源性產品中產ESBLs大腸埃希菌的分離、鑒定及耐藥基因型進行分析，為澳門地區雞源性產ESBLs大腸埃希菌的分布及其基因型分析提供可靠數據。

1 材料與方法

1.1試劑 瓊脂糖(MERCK)，Luria-Bertani培養液(DIFCO)，麥康氏培養基(青島高科園海博生物技術公司)，胰胨大豆瓊脂培養基(青島高科園海博生物技術公司)，Müller-Hinton瓊脂(BD)，胰胨大豆瓊脂培養液(BD)，EC-MUG培養液(BD)，瓷珠菌種保存管(南京歐克生物技術公司)，質粒提取試劑盒(QIAprep)，頭孢噻肟(Cefotaxime, CTX)，頭孢他啶(Ceftazidime, CAZ)，克拉維酸(Clavulanic Acid, CA)，多聚酶鏈反應混合液(碧云天生物技術公司)，PCR引物(生工生物工程公司)，TE緩沖液(生工生物工程)，UView Dye和無菌水(BIO-RAD)，DNA分子尺(上海捷瑞生物工程公司)，PstI酶(BBI)，PvuII酶(BBI)。

1.2儀器 Vitek2(Biomerieux),GeneAmp核酸擴增儀和NanoDrop分光亮度計(Thermo)，多重熒光冷光影像系統，電泳儀和電泳供電器(BIO-RAD)，水浴箱(Julabo)，超純水儀(Merck)，高溫高壓滅菌爐(HIRAYAMA)，臺式離心機(Labnet)。

1.3樣本來源 自2017年10月至2018年4月，以方便抽樣方式購買澳門地區巿售的不同批次、品種、農場及加工廠，并在保質期當中的69個雞源性產品。根據GB2707-2016《鮮(凍)畜、禽產品》[2]來定義樣本，且按照GB/T9695. 19-2008《肉與肉制品取樣方法》[3]和GB4789.1-2016《食品微生物學檢驗總則》[4]進行樣本的收集、貯存和運送。

1.4 菌株來源

1.4.1標準菌株 本次研究中使用到的標準菌株有大腸埃希菌(ATCC 25922)和肺炎克雷伯氏菌(ATCC 700603)。

1.4.2樣本菌株 參照GB16869-2005《鮮、凍禽產品》[5]的樣本抽取和檢驗流程，以無菌方式稱取25 g樣本，加入225 mL緩沖蛋白胨水，振蕩30 s后，從中吸取30 mL液體至無菌管中，并于44.5 ℃培養18～22 h。參照GB/T5750.12-2006《生活飲用水標準檢驗方法微生物指標》[6]中大腸埃希菌的鑒定方法，及美國臨床和實驗室標準協會CLSI M100 (2017)[7]的標準，取10 μL增菌后的緩沖蛋白胨水涂抹在含1 mg/L CTX的麥康氏培養基上，44.5 ℃培養18～22 h。挑取可疑菌落3～5株，接種在胰胨大豆瓊脂培養基上做純培養。把細菌接種到EC-MUG培養液，于44.5 ℃培養18～22 h后，在366 nm紫外燈下產生藍白色熒光，且產氣的為陽性菌株，進行Vitek2的生化鑒定。

1.5 菌株藥敏試驗及基因分型

1.5.1藥敏試驗及ESBL篩選與確認試驗 參考美國臨床和實驗室標準協會CLSI推薦的紙片擴散法(K-B法)[7]進行; ESBL初篩試驗，將待測菌液用均勻涂布于M-H 平板，貼上抗生素紙片頭孢他啶(CAZ 30 μg)和頭孢噻肟(CTX 30 μg)，經37 ℃培養18～24 h，測定抑菌圈的直徑，判斷依據美國臨床實驗室標準值。

確定試驗是采用CLSI的酶抑制劑增強雙紙片擴散法[7]。先將待測菌株配成0.5 麥氏濁度菌液，均勻涂布于M-H 平板， 取頭孢他啶(CAZ 30 μg)、頭孢噻肟(CTX 30 μg)、頭孢他啶/克拉維酸(CAC，30/10 μg)、頭孢噻肟/克拉維酸(CTC，30/10 μg)，35 ℃培養18～24 h；若單藥紙片(CAZ、CTX)與相應的紙片(CAC、CTC )中任何一對的抑菌環直徑之差≥5 mm， 即確認該菌株為ESBL 耐藥株。

1.5.2菌株保存 用瓷珠菌種保存管將菌株存儲于-20 ℃的環境中。

1.5.3質粒提取 用質粒提取試劑盒對菌株中質粒進行提取，并用NanoDrop分光亮度計進行檢測以確保有提取的質粒濃度達標，將提取好的質粒存放于-20 ℃環境中。

1.5.4基因分型 分別用CTX-M、TEM、OXA和SHV這4種不同的引物對產ESBLs大腸埃希菌的質粒進行擴增，并配以陽性對照、陰性對照及空白對照，反應條件參照參考資料[8-10]，引物序列參照表1。

1.5.5初步分群 用RFLP的方法對CTX-M的PCR擴增產物用PstI和PvuII進行切割，反應條件參照參考文獻[8]，之后將其電泳結果與文獻[8]進行對比，從而完成CTX-M分群。

表1 基因引物序列及擴增片段長度Tab.1 Primer sequences of genes and amplicon size

2 結 果

2.1產ESBLs菌株檢測結果 69個雞源性產品中有62個產品檢測出了產ESBLs大腸埃希菌，共分離出103株。

2.2產ESBLs基因分型結果 103株產ESBLs大腸埃希菌中，同一產品檢出基因型完全相同的菌株, 視為來自同一克隆, 最后非重復株有84株，其中CTX-M型、TEM型、OXA型和SHV型檢出率分別為98.8%(83/84)、25.0%(21/84)、3.6%(3/84)和0.0%(0/84)；其中23.80%(20/84)同時攜帶CTX-M型和TEM型，3.6%(3/84)同時攜帶CTX-M型和OXA型。ESBLs 4種分型PCR產物電泳結果見圖1；菌株得出ESBLs分型PCR產物電泳結果見圖2。

2.3初步分群結果 83株CTX-M型的產ESBLs大腸埃希菌中66.3%(55/83)為CTX-M-G1，31.3%(26/83)為CTX-M-G9，CTX-M-G2和CTX-M-G8的檢出率均為1.2%(1/83)。部分CTX-M型分群酶切后電泳結果，見圖3。綜合84個非重復菌株基因分型結果見表2。

M為100 bp DNA Marker；1為CTX-M；2為 TEM；3為OXA；4為SHV(Klebsiella pneumoniae ATCC 700603)圖1 4種基因分型PCR產物電泳結果Fig.1 Genotypes of four types ESBLs

M為100 bp DNA Marker；1為CTX-M；2為TEM；3為OXA圖2 菌株得出ESBLs分型PCR產物電泳結果Fig.2 PCR results of ESBLs isolates

2.4藥敏試驗 84個非重復株對12種測試藥物的耐藥情況結果見圖4。對氨芐西林耐藥率最高達98.8%(83/84), 其次為四環素83.3%(70/84)和阿米卡星78.6%(66/84), 碳青霉烯類的亞胺培南和美羅培南均未出現耐藥情況。對第三代頭孢菌素的耐藥程度不一, 其中以頭孢噻肟最高38.1%(32/84), 頭孢曲松次之34.5%(29/84), 而頭孢他啶最低10.7%(9/84)。 對4種以上抗生素的耐藥菌株占83.3%(70/84), 多重耐藥情況嚴重。

M為100 bp DNA Marker；1為 CTX-M-G1；2為 CTX-M-G2；3為 CTX-M-G8；4為CTX-M-G9。圖3 部分CTX-M型分群酶切后電泳結果Fig.3 RFLP result of CTX-M positive isolates

表2 84株產ESBLs 大腸埃希菌菌株基因分型檢測結果(n=84)Tab.2 Genotype of 84 isolates ESBLs producing E.coli

注: AMP為氨芐西林; CTX為頭孢噻肟; CAZ為頭孢他啶; CRO為頭孢曲松; FOX為頭孢西丁; GEN為慶大霉素; AMK為阿米卡星; CIP為環丙沙星; TCY為四環素; TZP為哌拉西林; IMP為亞胺培南; MEM為美羅培南圖4 雞源大腸埃希菌菌株對藥物的耐藥率Fig.4 Antibiotic susceptibility patterns of Escherichia coli isolates from chicken

3 討 論

本研究通過藥敏試驗的方式對雞源性產品中產ESBLs大腸埃希菌進行檢測，結果顯示出澳門地區雞源性產品中ESBLs占比高達89.8%(62/69)，相比中國其他地區，如哈爾濱79.6%[11]、青島83.1%[12]、河南62.8%[13]及香港72.0%[14]，澳門地區的檢出率最高，可能因為這些雞源性產品是用集中屠宰的方式進行屠宰，且加工過程中工具可能受到耐藥菌的污染，導致整個生產線受到污染，使所有雞源性產品都帶有耐藥菌，而其他地區的研究是包括活雞及凍雞，活雞含菌量雖然高，但通常單獨屠宰，推測交叉污染的機會比處理好的雞源性產品少。通過PCR的方法對產ESBLs大腸埃希菌進行基因分型，根據結果可知主要基因型為CTX-M型，其檢出率為98.8%，該數據與2010年中國雞源性產ESBLs大腸埃希菌CTX-M型檢出率96.43%[15]、2011年廣東地區CTX-M型檢出率83.4%[16]的數據相似。其他地區如哈爾濱CTX-M型流行率為71.5%[11]、青島CTX-M型流行率為100%[17]、河南CTX-M型流行率為89.8%[13]，說明澳門地區和中國內地的雞源性產ESBLs大腸埃希菌主要流行的基因型均為CTX-M型。但澳門地區的數據與遼寧的數據不相似，遼寧的雞源性產ESBLs大腸埃希菌的主要流行基因型為TEM型，其檢出率為100%[13]，而澳門地區TEM型的檢出率為25.0%，這說明了不同地區的耐藥基因型流行率間存在差異，可能是地域不同或抗生素的使用方法不同。同時本次研究還分別用PstI和PvuII這2種限制性內切酶對大腸埃希菌的CTX-M型基因擴增產物進行切割，根據切割結果可知其主要流行型為 CTX-M-G1型66.3%，其次為CTX-M-G9型31.9%，此數據也與山東[18]和深圳[19]CTX-M型大腸埃希菌中主要以CTX-M-G1和CYX-M-G9為主的數據相符。

產ESBLs細菌除了對第3代頭孢菌素耐藥外, 質粒上同時攜帶其他耐藥基因, 對氨基糖苷類、四環素類、氟喹諾酮類等抗菌藥物交叉耐藥, 本實驗結果顯示, 84個非重復株除了碳青霉烯類的亞胺培南和美羅培南均未出現耐藥情況外, 呈現4種以上耐藥占83.3%, 5種以上耐藥占54.7%, 可見多重耐藥的大腸菌株在澳門市售雞源性產品普遍檢出，容易通過食物鏈傳遞給人, 造成公共衛生的風險。澳門地區因禽流感的原因而限制活雞的進口，故澳門地區無活雞只有冰鮮雞或急凍雞，追溯這些冰鮮雞和急凍雞的來源可知它們分別來自9個不同食品公司加工廠。根據實驗數據可知不同雞場的基因流行率存在差異，這可能是因為不同雞場對抗生素的使用方式不同或在對雞源性產品的處理時有污染而導致的。為進一步探討本次實驗的數據與健康人群腸道中產ESBLs大腸埃希菌的流行率的相關性，需將兩者數據進行對比，進而了解兩者間的關聯。從而提高人們對耐藥菌株的產生的關注度，重視耐藥基因型的特征，做到合理使用抗生素，以降低耐藥菌的檢出率。

利益沖突：無