廣州市鼠形動物腸道產ESBL大腸埃希菌分布及病原特征分析

徐建敏，侯水平，張 晶，陶 霞，白志軍，吳新偉，周 勇

大腸埃希菌是臨床和社區感染最常見的機會致病菌，同時其耐藥性問題也越來越突出。中國細菌耐藥性監測網報道2005-2014年各監測醫院分離大腸埃希菌對頭孢噻肟和頭孢他啶的耐藥率顯著提升[1]。大腸埃希菌對頭孢類抗生素的耐藥機制主要是產生超廣譜beta內酰胺酶(ESBL)，在我國ESBL最常見的型別是CTX-M型[2]。

除了人，動物也是產ESBL大腸埃希菌的重要儲存宿主。養殖動物檢出產ESBL大腸埃希菌的比率往往比人更高[3]。近年來野生動物檢出ESBL大腸埃希菌也越來越受到關注，人社區周邊的野生動物受人類活動影響易從人類排放的污水、丟棄的垃圾以及醫療廢物等獲得人的耐藥菌[4-5]。鼠形動物是一大類外形相似、習性相近多個種類哺乳綱動物的統稱，包括一些嚙齒目和食蟲目動物，其分布廣，數量眾多。部分鼠形動物如嚙齒目鼠科的家鼠和食蟲目鼩鼱科的鼩鼱等習慣棲息于人的住房和各類建筑物中或周圍，與人類共處于同一生活環境，接觸頻繁，是多種人獸共患的傳染性細菌、病毒和寄生蟲感染的傳染源。社區環境中的鼠形動物可以通過直接接觸人群或間接接觸食物、水源、污水管道等途徑傳播耐藥性細菌和耐藥基因。但國內對于鼠形動物攜帶ESBL大腸埃希菌的耐藥機制研究較少，本文擬對廣州某居民生活區捕獲的鼠形動物腸道的ESBL大腸埃希菌進行鑒定，分析鼠形動物腸道ESBL大腸埃希菌的耐藥機制并對菌株進行分子分型。

1 材料與方法

1.1樣本收集 2016年9-11月，選擇廣州市城區內某居民區捕鼠。鼠籠布置地點為建筑物墻邊、下水道、垃圾桶、水溝等地點；以“晚放晨收”形式每月捕鼠1次，連續捕鼠3個月。對捕獲老鼠麻醉后處死，然后解剖鼠取腸道標本。

1.2材料與儀器 Viteck2 compact全自動細菌鑒定儀購自法國生物梅里埃公司；EC增菌肉湯購自OXID公司；SSI腸道分離平板為丹麥SSI產品；革蘭陰性菌鑒定卡以及革蘭陰性菌藥敏分析卡購自法國生物梅里埃公司；頭孢噻肟購自Sigma公司；PCR引物以及PCR產物測序由上海美吉生物科技公司完成。

1.3培養與分離 將腸內容物樣本加入含4 μg/mL頭孢噻肟的EC增菌肉湯30 mL中培養18～24 h，然后接種至含4 μg/mL頭孢噻肟的SSI腸道分離平板培養18～24 h。從SSI腸道平板上挑取紅色的單個菌落到血平板上培養后再使用Viteck 2 compact全自動細菌鑒定儀進行菌種鑒定。

1.4藥敏實驗 選擇AST-GN04革蘭陰性菌藥敏分析卡在Vitek 2 compact全自動微生物鑒定儀上對分離菌株進行抗生素敏感性分析，AST-GN04卡包含以下抗生素：青霉素類(氨芐西林、哌拉西林)；頭孢類(頭孢噻肟、頭孢吡肟、頭孢曲松、頭孢他啶)；單環-β內酰胺類(氨芐西林-舒巴坦、哌拉西林-他唑巴坦)；氨基糖苷類(慶大霉素、妥布霉素、阿米卡星)；喹諾酮類(環丙沙星、左氧氟沙星)和碳青霉烯類(亞胺培南)共14種抗生素。質控菌株為肺炎克雷伯菌ATCC 700603、大腸埃希菌ATCC35218和大腸埃希菌ATCC 25922。

1.5超廣譜β-內酰胺酶(ESBL)表型確認 經Vitek 2 compack藥敏實驗鑒定為可疑產ESBL菌落，按照美國CLSI 2016中推薦的產ESBL表型確認實驗進行驗證。采用雙紙片協同法，按CLSI要求進行，判定標準按2016版CLSI標準：頭孢噻肟-頭孢噻肟/克拉維酸、頭孢他啶-頭孢他啶/克拉維酸2對紙片中的任一對，含克拉維酸和不含克拉維酸紙片之間抑菌圈差≥5 mm即為陽性。

1.6ESBL耐藥基因檢測 對于blaCTX-M基因，先使用多重PCR檢測blaCTX-M的5個亞群，再針對每個亞群使用單重PCR檢測其全片段，然后送測序，結果通過Blast比對分析其具體blaCTX-M基因亞型[6]。OXA、SHV和TEM基因的引物和擴增參照文獻進行[7-8]。

1.7多序列位點MLST分型 在MLST官網上http://mlst.warwick.ac.uk/mlst/dbs/Ecoli獲取針對大腸埃希菌7個管家基因的引物序列和PCR擴增條件，7個管家基因包括：adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA和recA，PCR產物測序后將序列片段在官網上提交并獲得相應的ST型[9]。

1.8脈沖場凝膠電泳PFGE分型 參照國際食源性致病菌病原細菌分子分型監測網絡 (PulseNet) 中非O157 PFGE分型的標準操作方法進行。使用沙門菌H9812作為分子量Marker和質控菌。使用XbaⅠ限制性內切酶(50 U)，37 ℃酶切 2 h；電泳參數為6.76～35.38 s, 18 h；用BioNumerics 7.6軟件對基因圖譜進行聚類分析，生成聚類圖譜。

2 結 果

2.1鼠形動物監測結果 2016年9～11月期間，連續捕鼠3個月，共布置鼠籠600個，共捕獲鼠形動物123只，包括57只黃胸鼠、54只褐家鼠、11只臭鼩鼱和1只黑毛鼠。

2.2頭孢噻肟耐藥大腸埃希菌檢出情況與耐藥性分析 123份鼠形動物樣本共成功分離35株耐頭孢噻肟大腸埃希菌，檢出率為28.5%，經ESBL表型確認全部是產ESBL菌株。其中褐家鼠16只，黃胸鼠13只，臭鼩鼱5只，以及黑毛鼠1只。35株產ESBL菌株對氨芐西林、氨芐西林-舒巴坦、哌拉西林、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢吡肟、環丙沙星以及左氧氟沙星耐藥率很高，分別為100%、91.4%、97.1%、100%、100%、88.6%、80%和74.6%。對頭孢他啶的耐藥率和中介耐藥率分別是54.3%和45.7%。亞胺培南、阿米卡星、妥布霉素以及慶大霉素的耐藥率較低，分別為2.9%，2.9%，8.6%和31.4%(表1)。

2.3ESBL耐藥基因檢測結果 35株菌一共檢出CTX-M耐藥基因37個，有2株菌攜帶了2種CTX-M耐藥基因。檢出blactx-m-7923株，blactx-m-556株，blactx-m-1234株，blactx-m-152株，blactx-m-65和blactx-m-27各1株。未檢出OXA、SHV和TEM型ESBL基因。

2.4MLST 35株菌一共鑒定出23個ST型，其中較多的分別是CC206-ST206(4株)、CC10-ST10(3株)、ST457 (3株)、CC446-ST602 (2株)和ST6388 (2株)。詳見表2。

2.5PFGE 35株菌，除一株菌的基因組DNA降解而沒有獲得條帶外其余34株菌都獲得條帶，共獲得34種帶型，相似度為36.2%～96.3%。34株菌中包含2個PFGE帶型相似度較高的簇，其中簇1包含4株菌，相似度為90.6%～96.3%，簇2包含2株菌，相似度為95.7%(圖1)。

表1 35株產ESBL大腸埃希菌的抗生素敏感性分析結果(N=35)Tab.1 Antimicrobial susceptibility profiles of 35 ESBLs-producing E.coli isolates

表2 35株攜帶CTX-M基因的大腸埃希菌所屬不同序列型和克隆系的數量Tab.2 Distribution of sequence types and CTX-M genes among blaCTX-M-containing E.coli isolates according to clonal complexes

圖1 34株大腸埃希菌PFGE聚類圖Fig.1 PFGE clustering diagram of 34 strains

3 討 論

我們對廣州市某居民區的鼠形動物產ESBL大腸埃希菌的檢測結果顯示ESBL陽性率高達28.5%，所有ESBL陽性菌株均攜帶CTX-M型基因。 Ho等對香港18個區的鼠形動物進行ESBL大腸埃希菌檢測，發現不同區域之間檢出率差別較大，有2個區無檢出，有3個區檢出率高達21%～50%[10]；ESBL菌株中攜帶CTX-M型占92%，MLST顯示菌株遺傳多樣性。Guenther等[11]在德國柏林市區不同地點捕獲了老鼠87只，檢出67株產ESBL大腸埃希菌，陽性率高達77%。這些研究表明城市居民區鼠形動物攜帶的大腸埃希菌ESBL陽性率普遍都很高，說明鼠形動物可做為產ESBL大腸埃希菌的儲存宿主。

最近，孟加拉的一篇報道從在醫院周邊垃圾堆覓食的烏鴉中分離到產ESBL大腸埃希菌。烏鴉攜帶CTX-M型ESBL大腸埃希菌的檢出率高達59%，而且很多CTX-M型基因都是臨床患者常見的型別，說明醫院周邊野生動物可以從人獲得這些菌株或者CTX-M型基因[4]。國內鐘雪珊報道了在廣州市某三甲醫院周邊居民區鼠型動物攜帶肺炎克雷伯和銅綠假單胞菌的耐藥情況。發現肺炎克雷伯菌的多重耐藥率為40.9%，產ESBLs菌株檢出率為10.7%。肺炎克雷伯菌與銅綠假單胞菌的耐藥譜與目前臨床患者菌株的耐藥譜相似，提示這兩種細菌可能在鼠形動物與人之間有傳播[5]。由于醫院周邊環境易受醫院環境的影響，因此本文選擇遠離醫院的居民區進行鼠型動物耐藥菌的研究。

本研究從捕獲的123只鼠型動物分離到35株產ESBL大腸埃希菌，并從中檢出CTX-M耐藥基因37個。本研究檢出的所有CTX-M耐藥基因都曾在人臨床患者分離的耐藥菌株中檢出，如blactx-m-15是歐美國家產ESBL菌株中最常見的ESBL基因[12]。blactx-m-65和blactx-m-55基因在國內人臨床和健康人群較常見[13-14]，blactx-m-123近年來在國內人和動物都有檢出[15]。blactx-m-79在本研究中占據優勢地位，這一ESBL基因過去并不多見，但近年檢出增多。2008年，田素飛等[16]首次報道在沈陽某社區老年健康人群中分離到blactx-m-79大腸埃希菌。此后美國也報道在農場的小牛糞便中分離到blactx-m-79大腸埃希菌[17]，瑞士在江水中分離到blactx-m-79大腸埃希菌[18]，但這些文章中檢出的blactx-m-79大腸埃希菌數量都較少。本研究首次報道在鼠形動物中檢出blactx-m-79且檢出率較高。近幾年，國內也報道blactx-m-79在家禽和寵物犬的產ESBL大腸埃希菌中占優勢地位[19-20]。產CTX-M大腸埃希菌在動物與人群中的優勢型別存在差異的原因還不明了，甄盼盼等[21]研究認為某些CTX-M基因可以和其它耐藥基因特別是氨基糖苷類耐藥基因位于同一質粒上發生共同轉移，當動物養殖場使用氨基糖苷類抗生素，就易于篩選出產CTX-M大腸埃希菌并促進其擴散。blactx-m-79是否也存在這種因素，需后續對blactx-m-79基因的周圍序列進行深入研究來證實。

MLST發現35菌株多達23個ST型，而PFGE的結果也顯示帶型分布較為分散, 無優勢帶型，表明這些鼠形動物攜帶的ESBL菌株的遺傳多態性。目前的研究表明產ESBL大腸埃希菌攜帶的CTX-M基因大多位于細菌攜帶的質粒上，CTX-M基因可通過質粒在細菌之間水平轉移，從而提高CTX-M基因的傳播，需進一步實驗證實鼠形動物產ESBL大腸埃希菌的CTX-M基因是否位于質粒上，并分析質粒的傳播性以及鑒定耐藥質粒特征。

綜上所述，本文從123只鼠型動物檢出35株ESBL大腸埃希菌，檢出率高達28.5%，所有的ESBL基因型都是CTX-M型。本文檢出的CTX-M亞型中最常見的是blactx-m-79，需要進一步研究來分析blactx-m-79在鼠形動物中傳播的特征。MLST和PFGE的結果發現產ESBL大腸埃希菌菌株基因型呈現高度多態性。本研究結果表明鼠型動物是產ESBL大腸埃希菌的重要儲存宿主。

利益沖突：無