動物源性糞腸球菌Ebp菌毛亞單位蛋白多抗的制備及其對生物被膜形成的影響

郭珍珍, 張留君, 楚紅燕, 王鑫盛, 董家君, 王亞賓,2, 陳麗穎,2

腸球菌是人類和動物腸道重要的正常菌群，其數量僅次于大腸桿菌[1]，也是一種機會性致病菌。由于腸球菌對人和動物感染的嚴重性[2-5]以及多重耐藥的嚴峻性[6]，尋求和開發相關免疫性蛋白的新型免疫療法對腸球菌的預防治療變得尤為重要。

黏附、侵入和生物膜形成是細菌性病原體致病的關鍵環節[7-9]。生物信息學分析顯示糞腸球菌V583菌株表面毒力因子中有17種編碼細菌表面識別黏附矩陣分子(MSCRAMMs)和菌毛亞單位成分的LPXTG型細胞壁錨附蛋白[10]，而且僅有Ace、FSS1、FSS2、FSS3和EbpABC菌毛亞單位可以宿主黏附到胞外矩陣(ECM)蛋白[10-12]。進一步研究發現Ace和Ebp在糞腸球菌廣泛存在，且在人的心內膜炎和尿道炎感染中起著重要的作用[13-14]，它們均有可能成為預防糞腸球菌感染的免疫原性蛋白。

糞腸球菌Ebp菌毛由ebpC基因編碼的骨架蛋白以及ebpA和ebpB基因編碼的輔助蛋白組成[15]。來自其它革蘭氏陽性菌如肺炎鏈球菌、A群鏈球菌(GBS)和B群鏈球菌的研究表明，分揀酶催化錨定的菌毛亞單位(Sortaes-Assembled Pilus subunits)，其菌毛亞單位組合能夠誘導出依賴補體的調理吞噬殺死抗體和免疫保護抗體，可能成為發展新的免疫治療選項[16-18]。Ebp為糞腸球菌表面菌毛，其在糞腸球菌毒力因子中發揮著關鍵作用[19-20]，而且由糞腸球菌引發的心內膜炎病人血清中存在著較高滴度的抗EbpA、EbpB和EbpC抗體，證明Ebp在體內感染中可以良好表達[10]。目前，EbpA氮末端區域(EbpANTD)和EbpC已被證明具有預防小鼠導尿管相關的尿路感染(CAUTIs)和大鼠心內膜炎感染作用[21-22]，但對Ebp菌毛其他亞單位蛋白作用和動物源菌株作用尚未見報道。

本次通過生物學信息軟件對Ebp菌毛亞單位蛋白信號肽序列、胞外區和胞內區和抗原表位等進行預測，根據胞外區(去除信號肽區域)抗原表位預測結果，對抗原表位區域進行克隆、原核表達和純化，免疫新西蘭大白兔制備多抗，并進行了Western Blot特異性和生物膜阻斷試驗的功能性的初步驗證，以期為動物源性糞腸球菌的Ebp菌毛進行系統的研究和免疫預防等打下堅實的基礎。

1 材料與方法

1.1試驗動物和菌株 試驗用清潔級新西蘭大白兔購自河南省實驗動物中心，本試驗中所使用的糞腸球菌N9(ebpA、ebpB和ebpC陽性)、N30(ebpA、ebpB和ebpC陽性)、4-2a(ebpB、ebpC陽性)分離株與大腸桿菌 BL21均由本實驗室保存。

1.2試驗主要試劑與儀器 腦心浸出液肉湯(BHI)、溶菌酶、卡那霉素、蛋白酶抑制劑(PMSF)和Ni-Agarose填料均購自康為世紀生物科技有限公司；佐劑購自美國SIGMA公司；DNA抽提試劑盒(細菌)、DNA膠回收試劑盒、2×SDS PAGE Sample Loading Buffe購自生工生物工程有限公司；HRP-羊抗兔IgG和DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。PTC-200型PCR擴增儀(美國BIO-RAD公司)，DYY-6C型電泳儀，超凈化工作臺和-80 ℃超低溫冰箱(美國Thermo公司)，H1650-W型常溫離心機，JY98-Ⅲ型超聲波細胞粉碎機(購自上海新芝生物技術研究所)，電熱恒溫培養箱(購自上海躍進醫療儀器廠)。

1.4目的基因的PCR擴增 根據GenBank已發表的糞腸球菌OG1RF株的EbpA(ID:CP002621)、EbpB(ID:CP002621.1)和EbpC(ID:CP002621.2)序列，由 Primer Premier 5.0軟件進行引物的設計(加粗部分為保護性堿基，下劃線部分為酶切位點)，見表1。使用生工生物工程(上海)有限公司的 Ezup 柱式基因組 DNA 抽提試劑盒(細菌)提取糞腸球菌N9株的基因組DNA，通過PCR反應對目的基因進行擴增，總反應體系為50 μL：2×Tap PCR Master Mix 15 μL、上下游引物各1 μL、模板DNA3 μL、雙蒸水30 μL。PCR程序： 94 ℃預變性5 min，94 ℃變性1 min，退火1 min，72 ℃延伸，共35個循環，72 ℃延伸10 min。反應結束后，取8 μL產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5重組表達質粒的構建與鑒定 抗原表位片段基因經1%瓊脂糖凝膠電泳后，切膠使用生工生物工程股份有限公司的SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒對目的基因進行純化回收，將回收產物和pET-28a分別進行雙酶切，使用T4DNA連接酶將其連接，構建重組表達質粒 pET-28a-EbpA1、pET-28a-EbpA2、pET-28a-EbpA3、pET-28a-EbpC1、pET-28a-EbpC2 和 pET-28a-EF1092A(EbpB)，轉化入E.coliDH5α感受態細胞，同時利用含有50 μg/mL的卡那霉素LB固體瓊脂板進行篩選，挑取單個菌落在LB培養基中擴大培養。經菌液 PCR 初步鑒定后，提取陽性菌液的質粒進行雙酶切鑒定。將菌液PCR和雙酶切鑒定均為陽性的重組質粒送生工生物工程(上海)有限公司進行測序并對測序結果進行比對分析。

表1 引物序列及反應程序Tab.1 Primer sequence and reaction program

1.6重組蛋白的原核表達及純化 將測序正確的質粒轉化至E.coliBL21，37 ℃培養至對數生長期，經SDS-PAGE電泳檢測以確定最佳誘導條件。將得到的菌液4℃、3 000 r/mim離心收集菌體進行超聲破碎，分別取上清和沉淀進行蛋白電泳鑒定。包涵體蛋白采用尿素純化方法純化，可溶性重組蛋白采用鎳柱純化。

1.7多克隆抗體的制備 免疫前由耳緣靜脈采血分離血清作為陰性對照。首次免疫時將蛋白與弗氏佐劑乳化完全后免疫新西蘭大白兔，間隔14 d后使用弗氏不完全佐劑，之后每間隔7 d免疫1次。免疫完成后間隔1周進行采血分離血清，采用雙向免疫擴散法檢測抗體效價，若達到標準，大量心臟采血制備血清，-80 ℃保存。按照常規方法進行Western Blot分析，將重組蛋白經SDS-PAGE電泳轉至NC膜，兔免疫血清為一抗，HRP-羊抗兔IgG作為二抗檢測抗體的特異性。

1.8抗EbpA1蛋白、EbpA3蛋白和EbpC1蛋白的多抗對糞腸球菌生物膜阻斷情況 糞腸球菌N9、N30及4-2a株于TSB液體培養基37 ℃培養過夜，調整菌液濃度為1.5×108CFU/mL。取200 μL上述菌液接種于TSB液體培養基37 ℃培養過夜，用含0.25%葡萄糖的TSB液體培養基稀釋菌液，取其100 μL加入96孔板，同時每孔加入100 μL多抗，多抗的終濃度分別為1.5、0.75、0.375、0.187 5和0.093 8 mg/mL，每個梯度做6個平行，同時將含有相同數量不同菌株的糞腸球菌接種到含0.25%葡萄糖的TSB液體培養基中，按照與試驗組一致的生物膜培養方法培養，但不加入制備的多抗進行阻斷此作為陰性對照，將僅加入含有0.25%葡萄糖的TSB液體培養基，不加入糞腸球菌，然后與試驗組一起按生物膜培養方法培養，最后加入制備的多抗(進行阻斷)，此作為空白對照。37 ℃培養36 h后，PBS洗滌3次，待風干后用甲醇固定，1%結晶紫染色15 min，蒸餾水洗滌至無色，然后加入無水乙醇溶解結晶紫，讀取570 nm處的吸光度(A)值，所有試驗均一式3份進行。

2 結 果

2.1抗原表位預測結果 在去除Ebp菌毛胞內區和信號肽序列后，共預測了6個抗原表位，分別位于EbpA、EbpB和EbpC的N端，EbpA亞單位蛋白有3個抗原表位，氨基酸位置為1～389aa、390～755aa和751～1072aa，分別命名為EbpA1、EbpA2和EbpA3；EbpB有1個抗原表位，氨基酸位置28～438aa，命名為EbpB1；EbpC有2個抗原表位，氨基酸位置33～359aa和304～600aa，命名為EbpC1和EbpC2。

創新考核導向機制，解決“給足力”的問題。為避免“人在心不在，手到力不到”的問題，盡可能集聚起最強大的攻堅力量，強化了脫貧的考核權重，把促進貧困村經濟發展、農村貧困人口減少、農村居民人均可支配收入等作為重要考核內容，將鄉鎮和市直部門單位脫貧攻堅考核權重均提高至60%，并設立脫貧攻堅先進工作獎，把力量全部引導到脫貧攻堅上來，引導到真脫貧上來。

2.2抗原表位的PCR擴增 以糞腸球菌N9株的基因組DNA為模板，使用本試驗1.4的引物反應條件和反應體系對各抗原表位進行PCR擴增，擴增結果經瓊脂糖凝膠電泳，其結果與預期結果大小一致，見圖1。

M為DL2000 DNA Marker; 1為ebpA1; 2為 ebpA2; 3為 ebpA3; 4為ebp B1; 5為ebp C1; 6為ebp C2; 7為Negative control圖1 基因片段PCR擴增結果Fig.1 PCR amplification results of gene fragment

2.2重組表達質粒的鑒定 重組表達質粒 pET-28a-EbpA1、pET-28a-EbpA2、pET-28a-EbpA3、pET-28a-EbpC1、pET-28a-EbpC2和pET-28a-EF1092A (EbpB)雙酶切結果與預期結果相一致(圖2)，即在相應的質粒和片段處分別出現了相應的條帶，而且經比對后序列正確。

M為DL5000 DNA Marker; 1為 pET-28a-ebpA1; 2為pET-28a-ebp A2; 3為 pET-28a-ebp A3;4為pET-28a-ebp B1; 5為pET-28a-ebp C1; 6為pET-28a-ebpC2圖2 重組表達質粒的雙酶切鑒定結果Fig.2 Identification results of Recombinant expression plasmid through double Enzymatic digestion

2.3重組蛋白的表達及鑒定 優化條件后，重組質粒pET-28a-EbpA1、pET-28a-EbpA2、pET-28a-EbpA3、pET-28a-EbpC1、pET-28a-EbpC2和pET-28a-EbpB1的表達菌最佳誘導表達條件為：誘導溫度37 ℃、IPTG終濃度0.2 mmol/L、誘導時間6 h。重組蛋白EbpA1和EbpA2主要以包涵體形式表達，重組蛋白EbpA3、EbpC1、EbpC2和EbpB1主要以可溶性形式表達。各重組蛋白大小分別為46.7、45.0、39.4、50.0、39.3、36.0 kD，與預期結果一致，其純化結果見圖3。

M為Marker; 1-6為Represent the recombinant protein EbpA1、EbpA2、Ebp A3、EbpB1、EbpC1、Ebp C2 respectively;7為 BL21; 8為 pET-28a empty vector is induced; 9為 pET-28a empty vector is not induced圖3 重組蛋白的鑒定結果Fig.3 Identification results of recombinant protein

2.4多抗效價的測定 家兔免疫重組蛋白后進行采血制備血清，采用雙向免疫擴散實驗檢測抗血清效價，結果重組蛋白EbpA1、Ebp A2、EbpA3、EbpB1、EbpC1和 EbpC2的多抗的效價分別為1∶16、1∶8、1∶32、1∶64、1∶32和1∶64，證明6個抗原表位蛋白均具有較好的特異性。

2.5Western Blot分析結果 經原核表達并純化的EbpA1、Ebp A2、Ebp A3、Ebp B1、Ebp C1和EbpC2共6種重組蛋白經免疫印跡檢測，結果發現6種重組蛋白均可與多抗血清進行反應，其大小與預期結果一致，分別為46.7、45、39.4、50、39.3、36 kD，見圖4。

2.6各亞單位蛋白多抗對糞腸球菌N9、N30及4-2a株生物膜阻斷結果 糞腸球菌菌毛亞單位蛋白EbpA1、EbpA2、EbpA3、EbpB1、EbpC1、EbpC2多抗濃度對N9、N30以及4-2a菌株生物膜形成影響不同，而且僅有多抗EbpA1、EbpA3和EbpC1對糞腸球菌生物膜的形成有阻斷作用，因此僅研究多抗EbpA1、EbpA3和EbpC1的生物膜形成阻斷作用。多抗EbpA1和EbpC1在濃度為0.375 mg/mL時對N9和N30菌株生物被膜形成的阻斷作用最強，多抗EbpA3在濃度為0.75 mg/mL時對N9和N30菌株生物被膜形成的阻斷作用最強，而4-2a菌株只有在多抗EbpC1濃度為0.375 mg/mL時對生物被膜形成的阻斷作用最強，與陰性組相比，差異有統計學意義(FEbpA1-N9=6.645、FEbpA1-N30=5.089、FEbpA3-N9=3.633、FEbpA3-N30=4.441、FEbpC1-N9=4.338、FEbpC1-N30=6.149、FEbpC1-4-2a=5.880，均P<0.05)，如表2。

(a)(b)(d) M為Marker; 1為 Recombinant protein EbpA1、EbpA2、EbpB1; 2為 pET-28a empty vector is induced; 3為The recombinant plasmid was not induced;(c)(e)(f) M為Marker; 1為pET-28a empty vector is induced; 2為The recombinant plasmid was not induced; 3為Recombinant protein EbpA3、EbpC1、EbpC2圖4 各重組蛋白的免疫原性Fig.4 Immunogenicity of the recombinant proteins

3 討 論

一般來說毒力因子是預防細菌感染的良好免疫原，但在糞腸球菌眾多的公認毒力因子中，臨床感染菌株毒力因子攜帶數量和攜帶率僅是較其它來源的的菌株較高[6]，而且，血液菌株中腸球菌毒力因子表達與致病性沒有必然的相關性[23]。目前僅有AS被作為免疫原進行了評估，而AS在人心內膜炎和菌血癥菌株中的攜帶率僅分別為26%～52%和32%～77%[24]，在豬的臨床菌株中攜帶率僅為20.6%[6]。莢膜多糖是革蘭氏陽性細菌細胞壁主要成分，對腸球菌的致病性起著推動作用，但聚糖在各微生物之間是不同的，并且只有與載體蛋白結合后才能起到良好的免疫作用[23]。

菌毛是許多革蘭氏陽性細菌肽聚糖壁錨附的一種多聚蛋白結構，由于它的致病作用和抗體的易接近性，很容易成為抗體介入的目標[22]。Hendrickx等[25]已經評估了革蘭氏陽性無乳鏈球菌、化膿鏈球菌和肺炎鏈球菌菌毛疫苗的有效性，而且在多個動物模型中都可以提供明顯的保護作用。腸球菌與其他革蘭氏陽性細菌菌毛具有直系同源結構，而且，糞腸球菌Ebp菌毛在臨床分離菌株中的攜帶率超過94.59%，在屎腸球菌臨床分離菌株和環境分離菌株中的分離率也高達81.81%[26]。

表2 多抗EbpA1、EbpA3、EbpC1對糞腸球菌株生物膜生成的影響Tab.2 Effect of polyclonal antibody of EbpA1、EbpA3、EbpC1 on the biofilm information of E.faecalis strain

亞單位疫苗較傳統疫苗具有高安全性和高效性特點[27]。本次在ebpA、ebpB和ebpC基因共預測了6個抗原表位，其中EbpA1、EbpA3和EbpC1亞單位多抗在生物膜形成中有阻斷作用。多抗對N9、N30及4-2a菌株生物膜的不同阻斷能力可能是由于糞腸球菌Ebp表達效率不同，其表達效率在30%～72%之間[28]。本試驗中所用4-2a菌株由于缺失ebpA基因，導致多抗EbpA1和EbpA3對其生物膜形成的阻斷作用不明顯。Sillanp?? Jouko[21]等人觀察到ΔebpA缺失株與ΔebpABC三重缺失株的生物膜形成水平一致，而且發現ebpA的缺失能影響其他ebp菌毛亞單位的整體水平，進一步驗證了在生物膜形成過程中EbpA比EbpC重要，這在本試驗陰性對照中4-2a菌株生物膜形成量較N9和N30菌株低這一現象相一致。Flores-Mireles等[21]報道了人源糞腸球菌EbpA的氨基末端域具有免疫原性，其血清可以阻止小鼠尿道炎發生，Pinkston等[22]也報道了EbpC單克隆抗體可以保護小鼠免受心內膜炎的干擾，其中Flores-Mireles試驗結果與我們預測的結果基本一致。

菌毛在生物膜形成、黏附及侵入均有作用，本次僅對Ebp亞單位多抗對糞腸球菌生物膜形成的阻斷作用進行驗證，下一步工作將是對Ebp亞單位多抗對包括糞腸球菌在內的其他腸球菌的腸道細胞黏附、侵入阻斷作用以及對動物攻毒的保護作用進行實驗，以便進一步分析6個亞單位蛋白的免疫保護作用，為開發腸球菌免疫預防和治療以及血清學診斷方法奠定基礎。

利益沖突：無