細粒棘球蚴線粒體nad1基因的克隆與序列分析

于晶峰，桂 崢，武 琳，楊曉野，王 瑞，木 蘭

細粒棘球蚴是細粒棘球絳蟲(Echinococcusgranulosus)的中絳期幼蟲，是和人類接觸密切、感染人類的主要寄生蟲蟲種。全球畜牧業地區和中國西部的廣大地區，是細粒棘球蚴病(包蟲病)的流行區[1-2]。隨著我國經濟模式的改變和各省之間流動人口數量增加，先后有27個省份報道過人患包蟲病的病例，目前人感染細粒棘球蚴的病例數還在持續增加。到2018年包蟲病已被我國列為強制免疫的5種疾病之一。以往關于細粒棘球蚴蟲株的基因型分析和遺傳進化特點，經常使用線粒體細胞色素氧化酶1(CO1)基因作為標記，闡明某一地區細粒棘球蚴蟲株的所屬基因型和遺傳進化特點。前期查閱文獻[3-4]發現線粒體氧化脫氫酶1(nad1)基因與CO1基因相比，具有較高保守性的同時，其結構更加精簡、進化速度更快、種間蛋白基因序列差異更大。更加適合作為人體內寄生性絳蟲進化分類的遺傳學標記基因[5]。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1試驗樣品 本次研究中采集均來自于內蒙古錫盟西烏旗綿羊屠宰場以及錫林浩特市醫院收治的細粒棘球蚴病患者。其中調查的羊群中包括成年和幼年綿羊，共2 313只，其中患羊數量30只，收治的細粒棘球蚴病患者均經病理證實。所有患者均對本次研究知情同意。采用注射器(10 mL)吸出囊包中的囊液，進行離心處理，時間為1.5 min，分離原頭蚴和囊液，置于-20 ℃環境中待檢。

1.1.2菌種、載體及主要試劑 選自天根(北京)生化科技有限公司生產的大腸桿菌Top10感受態細胞、血液組織細胞基因組提取試劑盒(DP304)，天根(北京)生化科技有限公司生產的瓊脂糖膠回收試劑盒(DP209-03)，天根(北京)生化科技有限公司生產的pGM-T連接試劑盒(VT202-02)。選自大連寶生物工程有限公司生產的寶生物染料法熒光定量試劑盒、DL2000 DNA Marker、氨芐青霉素(Amp)以及大連寶生物工程有限公司生產的5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷(X-gal)、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、10×Loading Buffer。選擇北京市賽百盛基因技術有限公司生產的核酸染料以及內蒙古農業大學獸醫學院寄生蟲學研究室提供的氫氧化鈉等常規生化試劑。

1.2基因組DNA提取及PCR擴增 嚴格按照說明書要求操作，提取細粒棘球蚴原頭蚴基因組DNA。根據Yang JK等[6]的相關研究中的細粒棘球蚴nad1基因的引物序列，上游引物(nad1-F):5′-GGTGGTTGTTTTTGGGTTAG-3′和下游引物(nad1-R): 5′-GTTTGCTATTGTTAATTAA-3′由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

目的基因擴增以提取的細粒棘球蚴原頭蚴基因組DNA為模板各組分用量: Premix Taq 40 μL，nad1-F 4 μL，nad1-R 4 μL，模板4 μL，dH2O補足至80 μL。PCR反應條件為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性40 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 20 s， 35個循環；72 ℃完全延伸10 min。以1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，紫外燈下觀察結果，并采用照相系統對試驗結果進行記錄。

1.3擴增片段的克隆與測序 PCR產物純化，嚴格按照說明書操作。采用電泳后DNA凝膠回收的純化方法。按照pGM-T載體的說明書，連接PGM-T載體與回收的PCR產物(見表1)。載體與目的片段的摩爾比控制在1∶3～1∶8。在20 μL連接體系中16 ℃水浴連接過夜。反應完成后將PCR管迅速放于冰上獲得所需要的結果。

表1 連接反應Tab.1 Connection reaction

載體和PCR產的連接后，轉入處于能吸收周圍環境中DNA分子生理狀態的微生物細胞中，感受化細胞后，過夜培養，進行藍白斑篩選,挑取白色重組菌落，過夜培養后提取質粒，最近的一次轉化，置于2 mL LB液體培養基中(含有Amp)，150 r/min，37 ℃振蕩培養12～16 h，用無菌槍頭取1 μL進行菌液PCR鑒定。PCR反應體系為20 μL，反應條件同1.2的PCR擴增。菌落PCR檢測重組轉化結果，陽性菌液送檢。

1.4序列分析 按照15種絳蟲線粒體nad1基因相關資料表進行同源搜索。對序列覆蓋率、最大序列相似度、隨機匹配可能性等3個要因素進行綜合考慮，選取圓葉目、裂頭目、原頭目等其他科屬種的nad1基因的序列，運用DNAstar 軟件計算序列間的相似性，計算不同的種群或種之間的基因差異的程度，即遺傳距離。構建系統發育樹采用MEGA4.0軟件的最大似然法和鄰接法完成，系統發育樹(phylogenetic tree)進行自居檢驗，設定循環次數為1 000次。

2 結 果

2.1PCR擴增結果 以1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，結果見圖1。結果表明nad1基因在約895 bp 處獲得了特異性條帶，與預期片段大小吻合，無非特異性的擴增條帶(見圖1)。

M.DL-2000分子量標記；1.西烏旗樣本；2～7.錫林浩特樣本；8.陰性對照圖1 細粒棘球蚴nad1基因PCR產物電泳結果Fig.1 Electrophoresis results of PCR products of nad1 gene from Echinococcus granulosus

陰影部分分別為上下游引物；M.DL-2000分子量標記；1.西烏旗樣本；2～7.錫林浩特樣本；8.陰性對照圖2 陽性克隆菌液PCR鑒定電泳結果Fig.2 Electropherogram of positive clone bacterium by PCR amplification

2.2克隆結果 陽性菌液經PCR鑒定和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，在800～1 000 bp之間出現了清晰的特異性條帶(見圖2)。

2.3 測序結果細粒棘球蚴nad1序列

2.3.1西烏旗羊株nad1序列 西烏旗羊株細粒棘球蚴以nad1-F、nad1-R為引物，通過PCR擴增獲得了nad1基因部分序列，經處理獲得了長度為895 bp的序列，其中A的含量為19.44%，G的含量為25.92%，T的含量為46.59%，C的含量為8.04%， A的含量與T的含量相加為66.03%。

2.3.2錫林浩特市人株細粒棘球蚴nad1序列 錫林浩特市人株測序所得的序列長度也為895 bp，其A含量為19.44%，G的含量為25.92%，T的含量為46.82%，C的含量為7.82%，其中A的含量與T的含量相加為66.26%。

2.3.3序列比對結果 本次研究結果提示，內蒙古錫盟西烏旗羊株nad1基因序列與G1型nad1基因序列相同，而G1型nad1基因序列與錫林浩特市醫院收治的細粒棘球蚴病患者人株nad1基因序列與之間存在2個變異位點，這一結果提示二者均為G1基因型。

采用ncbi Blastp對本次研究中獲得的nad1序列進行同源分析，結果表明，內蒙古錫盟西烏旗羊株nad1基因序列與錫林浩特市醫院收治的細粒棘球蚴病患者人株nad1基因序列完全相同，基因型均為G1型。

2.3.4基因序列同源性與遺傳距離分析 內蒙古地區羊株nad1基因序列長度均為895 bp，而人株nad1基因序列長度也為895 bp，同源性分析結果提示二者細粒棘球蚴nad1序列完全相同，且將圓葉目、帶絳蟲科的加拿大棘球絳蟲的nad1序列與細粒棘球蚴nad1序列進行同源性分析，結果提示，相似性較高，可達到86.5%，而與圓葉目、帶絳蟲科的加拿大棘球絳蟲的基因差異程度很少，遺傳距離僅為0.139。與NCBI獲得的絳蟲科的的基因差異程度提示遺傳距離范圍為0.139～1.511，與肥胖帶絳蟲的基因差異程度最大，平均遺傳距離為0.8。

采用MP法和NJ法構建的系統發育樹結果顯示細粒棘球蚴nad1序列與帶絳蟲科的加拿大棘球絳蟲、多房棘球絳蟲位于同一分支，系統發育樹的自展值(Boostrap)均為100%(圖3、圖4)。細粒棘球蚴nad1序列所屬分支與裂頭目、裂頭科Diplogonoporus balaenopterae所屬分支相隔最遠(圖3、圖4)。

圖3 基于nad1構建的13種絳蟲之間的系統發育樹(MP-Maximum Parsimony法)Fig.3 Phylogenetic tree constructed between 13 kinds of tapeworm based nad1

圖4 基于nad1構建的13種絳蟲之間的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree constructed between 13 kinds of tapeworm based nad1

3 討 論

細粒棘球蚴病主要見于畜牧業比較發達的地區，其感染率的高低與多種因素密切相關，如生活習慣、氣候、居住條件以及自然條件等等。細粒棘球蚴的宿主適應性比較廣泛，其分布非常廣泛，世界各大洲牧區均可見其分布,在偶蹄類家畜以及犬動物之間循環的特點，而在我國綿羊/犬動物循環，有些寄生蟲能逃避宿主的免疫效應，在與宿主長時間的適應過程中發生了變異，有些寄生蟲在宿主體內寄生蟲時,其表面抗原性發生變異,直接影響免疫識別。國內外相關研究表明，全球范圍內將細粒棘球絳蟲劃分為10個基因型，我國主要以G1、G3、G6、G8型為主[7-8]。

細粒棘球絳蟲成蟲及其幼蟲嚴重危害人類健康和畜牧業發展，而研究表明，細粒棘球絳蟲的蟲株的鑒定難度很大，雖然對細粒棘球絳蟲的蟲株的分化特征和形態特征可以通過生物學以及形態學進行鑒定，但是鑒定過程中的影響因素較多，如宿主、環境等，均會影響鑒定結果，這一結果也提示基因水平上的差異并不是十分全面。進化都是以種群為單位的,所以單個生物的DNA序列是看不出進化信息的，由于DNA序列含有豐富的進化信息，甚至個別物種的基因組具有多于106堿基對，穩定性較高，組成DNA的堿基只有4種:ATCG,所以不同生物的堿基是相同的但不同生物的DNA堿基序列是不相同的[9-10]。因此，通過DNA序列進行分析來鑒定不同種生物體、亞種及地理株是具有重要的意義的[9-11]。

我們實驗室以往的研究表明：內蒙古兩個地區人株和羊株細粒棘球蚴CO1基因變異率均在1%以下，這種較明顯的株內變異現象，與新疆、甘肅和青海地區細粒棘球蚴基因型的變異情況大體相似(楊俊克等[6]文獻)。我們利用nad1基因作為遺傳標記，測得細粒棘球蚴內蒙古株的基因型也為G1型。與利用CO1基因作為標記得出的結論一致。并且生物遺傳學結果表明：用nad1基因做標記，序列差異大于 CO1基因種間序列差異，基于nad1基因的這一特點，可以被廣泛應用于研究多種動物性寄生蟲的種內和種間遺傳變異[12]。 由此可知：nad1的變異率還是比較低的，其基因較保守，基因突變一般是由于堿基的增添和缺失，但一般情況下不會發生缺失和插入，在一定程度上基因變異傾向于嘌呤被嘌呤替換或嘧啶被嘧啶替換，不是堿基對被另一個堿基對代替。本實驗也得出相同的結論，錫林郭勒盟錫林浩特市人株nad1基因序列，存在2個變異位點，為T與C轉換。樣品DNA序列里，堿基A+T含量約為66%，略高于魏玉環等[13]的報道。

本次研究中，通過對不同絳蟲nad1基因序列進行對比，結果提示我們雖然基因序列在種內相對保守，又存在一定的種間差異,可作為帶屬絳蟲分類鑒定。如將細粒棘球蚴與同屬帶絳蟲科的加拿大棘球絳蟲進行同源性分析，結果顯示同源性較高，達到了86.5%，而將演化關系較為疏遠的Diplogonoporus balaenopterae進行同源性分析，結果顯示同源性僅為75.2%。這一結果與CO1基因的進化分析結果十分相似。CO1的基因分析結果與nad1的基因進化分析結果均將細粒棘球蚴與加拿大棘球絳蟲化到了同一個分支，這一研究結果提示我們細粒棘球蚴與加拿大棘球絳蟲二者間發生分歧的時間較短，可能在生活習性方面還存在某些相似性。

利益沖突：無