半邊旗總黃酮對小鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用及機制研究

何曉文 陳品超 鄒燕 張女華 陳駒

腦血管疾病為人類三大死亡原因之一，其具有發(fā)病率、致死率、致殘率、復(fù)發(fā)率和治療費用高等特點，故其嚴重成脅人類健康和財產(chǎn)［1］，目前中國腦血管病患者約800萬人，平均每年約有160萬新發(fā)腦血管病患者，平均每10秒鐘就有一位腦血管病患者產(chǎn)生，可見其患病人數(shù)和發(fā)病率不容忽視［2］。然而缺血性腦血管病占全部腦血管病的85%［3］，而腦卒中又占缺血性腦血管病50%以上［4，5］，可見目前缺血性腦卒中是研究的重中之重。臨床上，針對于此類疾病一般采用西藥治療［6］，但是效果并不理想，中藥物種繁多，作用相對溫和，一般具有安全、低毒、有效等特點，具有多重性和復(fù)雜性的作用機制，充分顯示中醫(yī)藥是通過多組分、多層次、多靶點等作用優(yōu)點，而中藥有效部位避開了中藥復(fù)方組分復(fù)雜、有效成分分析困難、生物利用度低等弱點，其優(yōu)勢顯得更加明顯，因而從中藥尋找具有防治腦缺血再灌注損傷的有效成分是可行且必須的。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選擇144只C57小鼠，雌雄各半，體重18～22 g，隨機分為假手術(shù)組、模型組、陽性對照組及低、中、高劑量組，每組24只。

1.2 半邊旗黃酮成分的提取 參考相關(guān)文獻，具體方法如下：稱取具有質(zhì)量保證的半邊旗干燥全草，使用植物粉碎機粉碎，分別采用乙醇作為溶劑對不同濃度(30%、60%、90%)、不同用量(2倍、4倍、8倍體積)、不同提取時間(2、4、8 h)，按3因素正交實驗法設(shè)計優(yōu)選出最佳提取工藝。回收乙醇得半邊旗醇提取物浸膏，再以浸膏為原料依次使用石油醚、氯仿、乙酸乙酯進行提取，將乙酸乙酯提取液蒸干即得半邊旗黃酮粗品，最終通過薄板層析與高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析鑒定黃酮成分。

1.3 小鼠大腦中動脈缺血再注損傷模型的建立 利用血管內(nèi)線栓插線法建立小鼠大腦中動脈缺血再灌注模型，具體方法如下：腹腔注射戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉小鼠并仰臥固定于手術(shù)臺，37℃ 維持體溫，剪去頸部鼠毛，依次使用碘伏消毒液和75%酒精消毒頸部皮膚，切開頸部皮膚，小心暴露左側(cè)頸總動脈(CCA)約0.5 cm，分離并結(jié)扎頸外動脈(ECA)，于CCA近心端打一死結(jié)，上端打一活結(jié)。于體式顯微鏡下用顯微剪于CCA靠近死結(jié)端剪一小口，并用線栓插入CCA，打開活結(jié)，通過ICA進入大腦中動脈，縫合頸部皮膚，碘伏消毒液消詩傷口。缺血30 min后，拔出線栓，再灌注23.5 h。

1.4 半邊旗黃酮成分對小鼠大腦中動脈缺血再灌注損傷的影響 低、中、高劑量組于造模前3 d連續(xù)灌胃分別給予半邊旗總黃酮20、40、80 mg/(kg·d)，陽性對照組于造模前3 d連續(xù)灌胃給予阿司匹林50 mg/(kg·d)，假手術(shù)組、模型組灌胃給予等量生理鹽水。其中每組8只小鼠用于神經(jīng)功能缺損評分和大腦梗死體積觀察(TTC染色)，每組另8只小鼠用于腦勻漿抗氧化指標和炎癥指標檢測，每組剩下最后8只小鼠用于血腦屏障功能檢測。

1.5 觀察指標

1.5.1 神經(jīng)功能缺損評分 按照 Zea longa神經(jīng)功能5分評分方法評分。

1.5.2 大腦梗死體積占比測定 處死小鼠小心取出大腦，于生理鹽水中清洗干浄，冠狀切片，第一刀在腦前極與視交叉連線中點處，依次連續(xù)切4刀，成5片，每片厚約2 mm。迅速將腦片置于0.05%TTC溶液中避光染色，37℃ 孵育30 min［7］。30 min后，將腦片置10%福爾馬林中固定30 min，掃面儀掃描。利用image圖像處理軟件求出梗死區(qū)域占大腦總體積的百分比，即梗死體積占比。

1.5.3 腦組織勻漿SOD、CAT活性及MDA含量檢測左側(cè)腦組織稱重后按體重體積比1：9加入冰冷的生理鹽水，于冰浴上用超聲勻漿機勻漿，制成10%的勻漿液，3000 rpm離心10 min，取上清液按SOD、CAT、MDA說明書檢測步驟進行測定。

1.5.4 TNF-α 和IL-1β 含量測定 取上述適量腦組織勻漿，加上蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟200 μM，30000 g離心60 min，按酶聯(lián)免疫法試劑盒說明書檢測步驟檢測TNF-α、IL-1β 含量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS15.0統(tǒng)計學(xué)軟件對研究數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差()表示，采用t檢驗。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組神經(jīng)功能缺損評分及大腦梗死體積占比比較陽性對照組神經(jīng)功能缺損評分低于模型組，大腦梗死體積占比小于模型組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；低、中、高劑量組小鼠血清中神經(jīng)功能缺損評分低于陽性對照組，大腦梗死體積占比小于陽性對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。高劑量組小鼠血清中神經(jīng)功能缺損評分低于低、中劑量組，大腦梗死體積占比小于低、中劑量組；中劑量組小鼠血清中神經(jīng)功能缺損評分低于低劑量組，大腦梗死體積占比小于低劑量組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1 各組神經(jīng)功能缺損評分及大腦梗死體積占比比較()

表1 各組神經(jīng)功能缺損評分及大腦梗死體積占比比較()

注：與模型組比較，aP＞0.05；與陽性對照組比較，bP＜0.05；與低劑量組比較，cP＜0.05；與中劑量組比較，dP＜0.05

2.2 各組SOD、CAT活性及MDA、TNF-α、IL-1β含量比較 陽性對照組小鼠血清中SOD、CAT活性高于模型組，MDA、TNF-α、IL-1β 含量低于模型組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；低、中、高劑量組小鼠血清中的SOD、CAT活性高于陽性對照組，MDA、TNF-α、IL-1β 含量低于陽性對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；高劑量組小鼠血清中的SOD、CAT活性高于低、中劑量組，MDA、TNF-α、IL-1β 含量低于低、中劑量組；中劑量組小鼠血清中的SOD、CAT活性高于低劑量組，MDA、TNF-α、IL-1β 含量低于低劑量組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

表2 各組SOD、CAT活性及MDA、TNF-α、IL-1β 含量比較 ()

表2 各組SOD、CAT活性及MDA、TNF-α、IL-1β 含量比較 ()

注：與模型組比較，aP＞0.05；與陽性對照組比較，bP＜0.05；與低劑量組比較，cP＜0.05；與中劑量組比較，dP＜0.05

3 討論

腦血管疾病為人類三大死亡原因之一，其具有發(fā)病率、致死率、致殘率、復(fù)發(fā)率和治療費用高等特點，嚴重影響了患者的生活質(zhì)量及沉重的經(jīng)濟壓力。半邊旗又是我國常用的中藥材，有解毒、生肌、止血、消腫之功效，廣泛用于治療外傷出血、療瘡、吐血、跌打損傷、發(fā)背、目赤腫痛等［9］，具有潛在巨大的醫(yī)藥價值。

正常生物體內(nèi)自由基生成與清除處于動態(tài)平衡，腦缺血時，氧供應(yīng)不足，大量的自由基生成，使腦內(nèi)脂質(zhì)過氧化作用加強，導(dǎo)致細胞及細胞屏障損害，神經(jīng)元壞死或凋亡，引起和加重缺血腦組織水腫。再灌注恢復(fù)組織氧供應(yīng)，也提供了大量電子受體，使氧自由基在短時間內(nèi)爆發(fā)性增多［10］。因此SOD活性往往會作為TNF-α、IL-1β 作為炎癥反應(yīng)及免疫應(yīng)答的重要調(diào)節(jié)因子，參與損傷過程，加重腦損傷。

綜上所述，成功提取產(chǎn)量較多半邊旗總黃酮，成功建立小鼠腦中動脈缺血再灌注損傷模型，給予高、中、低劑量的半邊旗總黃酮后，可明顯改善上述指標并呈劑量依賴性。