基于de novo高通量測序的葉爾羌高原鰍微衛(wèi)星位點篩選與多態(tài)性分析

王錦秀 宋 勇,2 王新月 陳生熬,2 任道全,2*

（1塔里木大學動物科學學院，新疆 阿拉爾 843300）

（2新疆生產建設兵團塔里木畜牧科技重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300）

葉爾羌高原鰍（Triplophysa yarkandensis）地方名為狗頭魚，隸屬鯉形目、鰍科、條鰍亞科、高原鰍屬、鼓鰾鰍亞屬，廣泛分布于塔里木河水系，是塔里木河水系優(yōu)勢種[1-2]。目前關于葉爾羌高原鰍的研究主要集中在形態(tài)學[3]、生長繁殖[4]和線粒體[5]等方面，與種群遺傳和分子標記相關的研究還未見報道，種群遺傳信息的匱乏，將對其資源評估和有效地保護產生影響。

微衛(wèi)星，又稱短串聯(lián)重復序列（short tandem repeats,STR）或簡單串聯(lián)重復序列（simple sequence repeats,SSR）[6]，微衛(wèi)星標記具有多態(tài)性高、變異性強、數據易統(tǒng)計分析等突出優(yōu)點[7]，在各種分子遺傳標記中，微衛(wèi)星DNA標記技術受到許多研究者的青睞。魚類微衛(wèi)星標記開發(fā)中常用二堿基重復類型為主[8-9]，但也有學者認為三堿基重復較二堿基重復具有更高的篩選效率和多態(tài)性[10-11]。高通量測序除具有二代測序高效、快捷的普遍特點外，其片段讀長更大，因此更適合于微衛(wèi)星標記的開發(fā)[12]。

本研究基于高通量測序平臺對葉爾羌高原鰍基因組進行隨機測序并挑選出100對含二、三堿基重復的微衛(wèi)星序列設計引物，探索最佳PCR反應體系，篩選具有多態(tài)性的微衛(wèi)星標記，比較二、三堿基微衛(wèi)星標記的篩選效率和多態(tài)性差異，并檢測塔里木河支流五處采樣點的葉爾羌高原鰍野生群體的遺傳多態(tài)性，旨在為葉爾羌高原鰍的種群遺傳結構和遺傳多樣性分析提供技術基礎，為塔里木河特有魚類的保護積累資料。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與基因組DNA提取

葉爾羌高原鰍采集于塔里木河支流的五處采樣點，分別是阿克蘇河17尾，臺南河18尾，阿爾干25尾，臺特瑪湖15尾，車爾臣河27尾，共計102尾。每個樣品取20 mg鰭條，使用血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒（慈達生物技術有限公司,DP348）提取基因組織DNA。用核酸蛋白檢測儀（上海創(chuàng)萌生物科技有限公司,DS-11）檢測基因組DNA的濃度及純度，并用1%的瓊脂糖電泳檢測（BIO-RAD,164-5056），將提取純度較好的DNA-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 高通量測序與引物合成

采用HiSeq PE150模式（雙端測序）測序（上海生工），進行基因組de novo組裝，在獲取拼接基因組序列后，使用MISA對序列中的SSR進行了檢測，SSR最小間距為200 bp。隨機挑選100個二堿基重復、三堿基重復且重復次數在十次以上的微衛(wèi)星序列（真核生物基因組中，二堿基重復的微衛(wèi)星最為豐富，三堿基重復的微衛(wèi)星比二堿基重復微衛(wèi)星的含量低10倍，四堿基重復的微衛(wèi)星與之相比，含量更少[13]）進行引物開發(fā)，送至公司進行引物合成。

1.3 引物最佳退火溫度的篩選

葉爾羌高原鰍基因組DNA對100對SSR引物進行PCR擴增，篩選出PCR反應過程中的最佳退火溫度，優(yōu)化PCR反應條件，并對引物進行首輪篩選，篩選出瓊脂糖檢測能擴增出穩(wěn)定且均一目的片段的SSR引物。PCR反應體系總體積為30 μL，其組成為PCR Mix15 μL（天根，北京），DNA模板3 μL，上游引物Forward 1.5 μL，下游引物Reverse 1.5 μL，剩余體系雙蒸水補足。反應條件95℃預變性3 min，94℃變性 30 s，退火 30 s（溫度 1：62℃、2：61.2℃、3：59.6℃、4：56.9℃、5：53.5℃、6：50.8℃、7：48.9℃、8：48℃），72℃延伸40 s，以上程序循環(huán)34次，最后72℃繼續(xù)延伸10 min。

1.4 引物多態(tài)性檢測

以8尾葉爾羌高原鰍個體的基因組DNA為模板對能夠擴增出穩(wěn)定條帶的SSR引物進行多態(tài)性篩選。PCR反應體系同上，退火溫度為上步驟篩選得出。反應產物采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，經0.1%硝酸銀染色后在化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)（BIORAD ChemiDoc Imaging System）下拍照保存。將擴增產物基于Fragment Analyzer 5200毛細電泳平臺進行基因分型，檢測引物是否具有多態(tài)性，并得到微衛(wèi)星的基礎數據（北京華世百奧生物技術有限公司）。

1.5 數據處理與分析

原始數據通過CONVERT1.31軟件轉化為各軟件所需格式。利用Cervus3.03軟件計算出幾個群體葉爾羌高原鰍的等位基因數（Na）、有效等位基因數（Ne）、觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、多態(tài)信息含量（PIC），利用PopGen32進行群體內Hardy-Weinberg平衡檢測。

2 結果

2.1 高通量測序結果與微衛(wèi)星位點分析

圖1 各堿基重復微衛(wèi)星序列所占比例

高通量測序共獲得27 802條存在微衛(wèi)星位點的序列，總長度為2 056 661 bp，最大長度為21 111 bp，最小長度為185 bp，平均長度為1 637 bp。圖1為葉爾羌高原鰍各堿基重復類型在所有微衛(wèi)星序列中所占的比例，其中單堿基重復是葉爾羌高原鰍最主要的微衛(wèi)星類型，占44.59%，其次二堿基、三堿基重復，占全部微衛(wèi)星序列的34.34%、12.46%，前三者占全部微衛(wèi)星序列的91.39%，而四堿基（2.53%）、五堿基（2.86%）、六堿基（5.22%）只占全部微衛(wèi)星序列的8.61%。同時在堿基類重復型中二堿基重復次數在6～61次，三堿基在5～31次，四堿基在7～27次、五堿基在6～12次，六堿基在5～17次，堿基數越大，重復次數逐漸減小，相應微衛(wèi)星數量變少。

2.2 引物最佳退火溫度的選擇

100對引物中經瓊脂糖檢測出能擴增出穩(wěn)定且均一的目的片段的微衛(wèi)星引物共79對，有21對引物經瓊脂糖檢測不能擴增出穩(wěn)定且均一目的片段，兩條引物上的互補堿基相結合形成二聚合體，導致DNA無法與其相結合，使得擴增效率降低，將其舍去。圖2為葉爾羌高原鰍部分引物（Y7、Y8、Y23、Y24）經不同溫度（1：62℃、2：61.2℃、3：59.6℃、4：56.9℃、5：53.5℃、6：50.8℃、7：48.9℃、8：48℃）PCR后瓊脂糖電泳檢測結果。引物Y7在62℃、61.2℃、59.6℃、56.9℃、53.5℃、50.8℃條件下條帶較明亮且清晰，因此50.8～62℃均可成為引物Y7的最佳退火溫度；引物Y8在61.2℃條件下條帶明亮且清晰，因此將61.2℃設為引物Y8最佳退火溫度；引物Y23在59.6℃條件下條帶明亮且清晰，故61.2℃為Y23的最佳退火溫度；引物Y24在61.2℃、59.6℃條件下條帶明亮且清晰，將61.2℃設為Y24的最佳退火溫度，其余引物亦按此方法篩選。

圖2 葉爾羌高原鰍SSR引物瓊脂糖凝膠電泳

2.3 多態(tài)性檢測及引物信息

以8尾葉爾羌高原鰍個體的基因組DNA為模板，79對微衛(wèi)星引物中，只有33對引物經聚丙烯酰胺凝膠電泳后，條帶顯示出特異性，表示其具有多態(tài)性。圖3為部分引物（Y7、Y11、Y45）經硝酸銀染色后得到的，引物Y7片段大小在203～238 bp，引物Y11片段大小在101～136 bp，引物Y45片段大小在188～212 bp，電泳后得到的目的片段出現條帶不同的現象，說明具有多態(tài)性，其余引物亦按此方法篩選。33對引物經毛細電泳平臺進行基因分型，得到微衛(wèi)星的基礎數據，如表1所示。

圖3 葉爾羌高原鰍SSR引物聚丙烯酰胺凝膠電泳

表1 葉爾羌高原鰍微衛(wèi)星位點及PCR引物信息

（續(xù)表）

2.4 葉爾羌高原鰍微衛(wèi)星位點的分離及多態(tài)性分析

33對多態(tài)性的微衛(wèi)星位點對102尾葉爾羌高原鰍進行遺傳變異和遺傳多態(tài)性檢測，引物在葉爾羌高原鰍群體中進行擴增，得到群體的遺傳多樣性信息見表2。葉爾羌高原鰍的等位基因數介于24～52，有效等位基因數Ne介于4.040～30.626之間，平均等位基因和有效等位基因數分別為43.848、12.163。其中Y96位點的等位基因數最少，為 24，Y7、Y11、Y17、Y28、Y32、Y42、Y44、Y49等位點的等位基因數最多，為52。各個位點的香農多樣性指數介于2.012～3.699之間，觀測雜合度Ho介于0～0.957之間，多態(tài)信息含量PIC介于0.729～0.972之間。對各位點進行Hardy-Weinberg平衡檢測，發(fā)現有22個（67%）位點符合Hardy-Weinberg平衡（PHWE＞0.05），有11個（33%）位點顯著偏離 Hardy-Weinberg平衡（PHWE＜0.05）。與三堿基重復類型微衛(wèi)星相比，二堿基類型微衛(wèi)星標記的多態(tài)性無論是等位基因數Na、觀測雜合度Ho，還是多態(tài)信息含量PIC等參數都明顯比三堿基重復類型的高。

表2 葉爾羌高原鰍微衛(wèi)星標記的遺傳學特征

（續(xù)表）

3 討論

不同引物的退火溫度不一樣，從特異性和條帶數量角度考慮，確定合適的退火溫度十分必要[14]。本研究中葉爾羌高原鰍100對引物的退火溫度也不同，能擴增出穩(wěn)定條帶的79對微衛(wèi)星引物退火溫度大多在56.9～62℃效果較好，說明其引物的最佳退火溫度在56.9～62℃范圍內，高于西昌華吸鰍（Sinogastromyzon sichangensis）[15]51～60℃的退火溫度，中華金沙鰍（Jinshaia sinensis）[16]的退火溫度在 51～57℃之間，長體圓鲹（Decapterus macrosoma）[17]退火溫度在55～60℃之間，塔里木裂腹魚（Schizothorax bid-dulphi）[18]的退火溫度在 54～57℃之間，不同種類魚類退火溫度不盡相同，這可能與其序列所含堿基的比例相關，有待進一步研究。從本研究的結果可以看出，一二三堿基是葉爾羌高原鰍的主要微衛(wèi)星堿基類型，四五六堿基類型相對較少，隨堿基數量的增加，微衛(wèi)星數量逐漸減少的現象，這與Chistiakov、屈政委、黃杰[19-21]等學者研究的微衛(wèi)星組成情況類似，說明在葉爾羌高原鰍微衛(wèi)星標記的開發(fā)中二三堿基是主要的篩選對象。在堿基類重復型中二堿基重復次數在6～61次，三堿基在5～25次，四堿基在7～27次、五堿基在6～12次，六堿基在5～17次，發(fā)現堿基數越大，重復次數越小，這與呂振明[22]等研究的曼氏無針烏賊微衛(wèi)星位點篩選的結果一致。從具有多態(tài)性的33對微衛(wèi)星標記中發(fā)現二三堿基重復類型微衛(wèi)星相比，二堿基類型微衛(wèi)星標記的多態(tài)性無論是等位基因數Na、觀測雜合度Ho、多態(tài)信息含量PIC等參數都明顯比三堿基高，這與房祖業(yè)[13]等研究大刺鰍二、三、四堿基重復微衛(wèi)星標記的篩選結果一致，這也提示了更為有效的篩選多態(tài)性微衛(wèi)星標記，二堿基類型將是首先篩選的對象。

多態(tài)信息含量PIC是評價微衛(wèi)星位點的重要參考標準，PIC＞0.5表明該位點具有較高的多態(tài)性，0.25＜PIC＜0.5表明該位點具有中度多態(tài)性，PIC＜0.25表明該位點具有低度多態(tài)性[23]。張智等[15]等對利用高通量測序法對西昌華吸鰍基因組進行測序并篩選出29對具有多態(tài)性的引物，平均等位基因數為14.5，觀測雜合度（Ho）和期望雜合度（He）分別為0.620和0.882，多態(tài)信息含量（PIC）為0.859，引物在西昌華吸鰍中表現出較高的多態(tài)性。李薇[24]等通過高通量測序成功篩選出達氏鱘（Acipenser dabryanus）25個微衛(wèi)星位點，每個位點的等位基因數（Na）為4～11（平均值7.2），觀測雜合度（Ho）為0.160～1.000（平均值0.744），期望雜合度（He）為0.346～0.875（平均值0.727），除了其中一個位點以外，所有位點的多態(tài)信息含量（PIC）均大于0.5，其多態(tài)性較好。本研究基于高通量測序技術共篩選出33對具有多態(tài)性的微衛(wèi)星位點，并用于檢測塔里木河干流葉爾羌高原鰍野生群體的遺傳多態(tài)性，其多態(tài)信息含量PIC介于0.729～0.927之間，表明這33個位點均具有多態(tài)性（PIC＞0.5），塔里木河支流葉爾羌高原鰍野生群體具有較高的遺傳多樣性。33個位點中有11個位點顯著偏離Hardy-Weinberg平衡，這種現象可能與樣本量及無效等位基因的存在有關[25]。由于微衛(wèi)星標記具有通用性，本文篩選出葉爾羌高原鰍的微衛(wèi)星引物，同樣可用于其他高原上的鰍科魚類，亦可參照此引物來進行實驗分析。

4 結論

本研究的結果表明，基于de novo的高通量測序技術是開發(fā)葉爾羌高原鰍微衛(wèi)星標記的理想方法。與傳統(tǒng)的DNA建庫和探針雜交富集法開發(fā)微衛(wèi)星標記相比，具有快速、高效等優(yōu)點。本研究表明二堿基重復類型的微衛(wèi)星標記在葉爾羌高原鰍中占優(yōu)勢，多態(tài)性較好，且本研究篩選的33對多態(tài)性引物可以應用于群體間遺傳多樣性、遺傳距離和遺傳圖譜的構建，以及親緣關系的鑒定等方面，為葉爾羌高原鰍種質資源保護研究奠定分子基礎。