兩種牧草在青貯過程中氮轉化動力學的比較

吉國強,劉瑞霞,杜秀娟

(山西林業職業技術學院,山西太原 030009)

青貯是牧草收獲后保存的常用方法，但由于青貯過程中蛋白質發生水解，從而降低了蛋白質的品質。對于一些青貯飼料（如紫花苜蓿），蛋白水解損失可能特別高，其蛋白降解率為飼料蛋白的44% ～87%（馬春暉等，2010）。飼料蛋白可轉化為非蛋白氮（氨、氨基酸和小肽），反芻動物對其利用不高，不僅給養殖者造成巨大的經濟損失，而且給環境造成巨大的氮負擔。不同的因素會影響蛋白水解的速率和程度，其中pH 的下降速度在降低蛋白降解速率中起關鍵作用。同時，其他因素（如飼料品種）也可能影響牧草青貯過程蛋白質水解的程度。與紫花苜蓿相比，紅花苜蓿的蛋白質水解程度較低，只有7% ～40% 的蛋白質在青貯過程中被降解，導致這種差異的主要因素與紅花苜蓿中天然蛋白保護機制的存在有關，即多酚氧化酶的活性可以催化內源酚類物質氧化為醌類物質，這些醌與細胞蛋白上的親核位點發生反應，形成蛋白- 酚復合物，以抵抗蛋白水解或滅活蛋白酶（Van Ranst 和 Lee，2011）。但雖然多酚氧化酶可以降低蛋白質的水解，但還不清楚紫花苜蓿和紅花苜蓿青貯過程氮組分的變化情況。此外，有研究表明，紅花苜蓿蛋白質水解的降低是由于多酚氧化酶使植物蛋白酶失活的結果（Lee，2014）。牧草蛋白質在青貯過程中的降解是一個涉及植物和微生物蛋白酶的過程，而多酚氧化酶的存在是否會影響微生物的活性目前尚不清楚。放射處理是一種常用來區分微生物活性作用和植物酶作用的方法。許多研究表明，放射處理能有效殺菌，但對植物酶的影響很?。―ing 等，2013）。本研究旨在研究紫花苜蓿和紅花苜蓿青貯過程氮的動力學特征，以及放射處理這兩種牧草后對氮和微生物活性的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗設計與原料青貯 分別將750 g 切碎的紫花苜蓿和紅花苜蓿裝入1 L 的帶蓋筒倉中，稱重后用塑料蓋和膠帶封好。將含有紫花苜蓿和紅花苜蓿的筒倉分為兩組，一組由γ- 射線在室溫下放射處理2 h。根據Ding 等（2013）研究發現，這種方法放射處理能有效抑制青貯牧草中的微生物活性。因此，本試驗分為4 個處理組：未經放射的紫花苜蓿青貯飼料、放射處理的紫花苜蓿青貯飼料、未放射的紅花苜蓿青貯飼料和放射處理的紅花苜蓿青貯飼料。這些筒倉儲存在18 ～22℃下，每個處理由16 個筒倉組成，并在青貯1、4、8 和30 d 后打開筒倉。在筒倉開啟時將其轉移到一個塑料箱中均勻混合，然后采集樣品進行化學和微生物分析。

1.2 化學及微生物分析 將約0.5 kg 新鮮飼料和青貯飼料樣品在60℃下烘干48 h，以測定干物質含量。干燥后的樣品經粉碎后過1 mm 分析篩，用于總氮分析。在70 mL 去離子水中加入30 g新鮮牧草和青貯飼料，4℃下提取24 h，得到冷提取液，按照Chen 等（2015）的方法測定青貯飼料的發酵參數。水提取液用pH 計測定pH。采用高效液相色譜法測定乳酸、乙酸、丙酸、丁酸和乙醇的含量。將10 L 25% 三氯乙酸溶液加入到40 mL 提取液中，室溫靜置1 h，使蛋白質沉淀，4℃、18000×g 離心15 min，上清液分別檢測氨氮、游離氨基酸氮、肽氮和非蛋白氮（Licitra 等，1996）。

取0.5 kg 的放射處理后的枯萎牧草，測定微生物（乳酸菌、酵母菌和好氧菌）數量。參考Winters 等（2008）的方法分析多酚氧化酶活性。

1.3 統計分析 所有試驗數據均采用SAS 軟件進行MIXpro 程序分析。發酵參數、氮組分數據采用以下模型 ：Yijk=μ+ Si + Aj + Tk + Si×Aj + Si×Tk +Aj Si××Tk + Aj×Tk +?，其中 Si 為青貯時間，Aj 為固定效應（牧草品質），Tk 為固定效應（放射處理）。在同一模型中測試了這些效應之間的相互作用。采用Tukey 法進行多重比較，P＜0.05 表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 兩種牧草化學成分 由表1 可知，兩種牧草的化學成分無顯著差異（P＞0.05）。

表1 紫花苜蓿和紅花苜蓿的營養成分

2.2 多酚氧化酶和微生物組成 由表2 可知，在紫花苜蓿中沒有檢測到多酚氧化酶活性，而在紅花苜蓿中多酚氧化酶活性較高，達到15.6 U/g。放射處理對紅花苜蓿多酚氧化酶活性無顯著影響（P＞0.05），其中放射處理組紅花苜蓿多酚氧化酶活性達到14.1 U/g。放射處理顯著降低了牧草乳酸菌、酵母菌和好氧菌數量（P＜0.05）。

表2 放射處理對牧草多酚氧化酶和微生物組成的影響

2.3 牧草發酵參數 由表3 可知，牧草放射后青貯的發酵參數與非放射青貯的發酵參數不同。其中，放射組牧草青貯飼料的pH 顯著高于對照組（P＜0.05），發酵終產物（乳酸、乙酸和乙醇）無顯著差異（P＞0.05）。相比之下，未放射的青貯料在整個發酵過程中發酵強度更強，pH 下降幅度更大，發酵終產物積累量更多。

表3 放射處理對牧草發酵參數的影響

2.4 氮成分 由表4 可知，紫花苜蓿青貯飼料中肽氮含量顯著高于紅花苜蓿（P＜0.05）。在第1 天放射處理后顯著提高了青貯紫花苜蓿肽氮含量（P＜0.05）。與肽氮相似，在紫花苜蓿青貯的第1 天前，與紅花苜蓿青貯相比，氨基酸氮的增加更大（P＜ 0.05）。第 4 ～ 30 天，放射組較對照組顯著降低了兩種青貯牧草的氨基酸氮水平（P＜0.05）。與紫花苜蓿青貯相比，紅花苜蓿在整個青貯過程中氨氮含量均較低（P＜0.05）。放射降低了兩種青貯牧草的氨氮水平（P＜0.05）。試驗結束時，紫花苜蓿和紅化苜蓿的非蛋白氮濃度分別提高了5.50 倍和4.85 倍，非蛋白氮增長最快的是第1 天。

表4 放射處理對牧草氮成分的影響

3 討論

3.1 γ- 射線放射處理牧草對微生物活性的影響 為了分離植物和微生物活動對青貯牧草中氮成分的影響，本研究利用放射處理來達到這種目的。有些細菌（如梭狀芽孢桿菌的芽孢）對放射處理有很強的抗性，如果劑量適當，對植物酶沒有或只有輕微的損傷（Merry 等，1995）。在本試驗中，無論放射處理與否，兩種青貯牧草中均未檢出丁酸（數據未列出），這可能是由于新鮮牧草中梭狀芽孢桿菌的數量較少。放射處理后對紅花苜蓿多酚氧化酶活性無顯著影響，這在一定程度上反映了放射處理對植物酶活性無顯著影響。總的來說，γ- 射線放射處理有效抑制了微生物的活動，但對植物酶活性影響不大。

3.2 青貯牧草的氮動力學變化 植物蛋白在青貯過程中的降解是不可避免的，會導致真蛋白轉化為營養價值較低的非蛋白氮。蛋白質轉化過程涉及兩個已知的步驟：首先是肽鍵水解，形成游離氨基酸和肽。其次，氨基酸被進一步分解成氨、有機酸和胺，其中植物蛋白酶主要負責將真蛋白轉化為游離氨基酸和多肽，而進一步的氨基酸代謝是微生物蛋白酶的產物（Henderson 等，1982）。作為水解的直接指示物，多肽是通過蛋白質水解形成的，并通過微生物的脫氨和脫羧作用進一步降解。與青貯紫花苜蓿相比，無論放射處理與否，紅花苜蓿在青貯初期的肽氮含量較低，說明蛋白水解作用較少。作者認為，這種較低的蛋白質分解可能是由于多酚氧化酶的作用使植物蛋白酶失活所致。此外，蛋白質- 酚結合降低了蛋白質的溶解度，降低了青貯過程中蛋白質的分解（Hart等，2016）。但放射處理紅花苜蓿青貯后未觀察到肽氮的增加，這可能是由于植物蛋白酶活性低，即使在良好的青貯條件下也不能引起更大程度的蛋白質水解。

由于肽和游離氨基酸都是真蛋白的水解產物，二者在青貯過程中的動力學關系密切。與肽類似，微生物可消耗游離氨基酸作為脫氨生成氨氣的底物，其含量在很大程度上取決水解和脫氨之間的相對活性。與放射處理組相比，對照組紫花苜蓿和紅花苜蓿青貯在第4 和30 天表現出更高的游離氨基酸氮。在青貯后期，微生物蛋白酶活性逐漸取代了植物蛋白酶的主導活性，導致更多的游離氨基酸氮產生。作為氨基酸進一步的分解產物，氨是由微生物活動而不是由植物酶產生的（Guo 等，2007）。本研究發現，在整個青貯過程中，青貯紅花苜蓿比紫花苜蓿的氨含量低，這可能是因為紅花苜蓿的弱蛋白水解導致用于微生物脫氨的游離氨基酸底物更少。由于放射處理抑制了微生物活動，其氨含量也較低。無論哪種牧草，非蛋白氮在青貯第1 天的增長速度最快，說明大部分蛋白質的分解發生在青貯的第1 天，這與Guo等（2007）的研究結果一致。在青貯結束時，非放射處理組牧草青貯后較對照組非蛋白氮濃度的微小差異揭示了微生物蛋白酶在青貯過程中是從屬作用（Ding 等 2013）。

4 結論

本研究反映了放射處理對豆科物種青貯過程微生物活性的影響，紫花苜蓿和紅花苜蓿的氮轉化模式不同，特別是在青貯期，與紫花苜蓿相比，紅花苜蓿多酚氧化酶的存在對微生物活性有一定影響，但受多酚氧化酶影響較小。