SCFAs對奶牛瘤胃上皮細胞Ca2+信號通路相關基因表達的影響

寧麗麗 成 健 詹 康 楊天宇 姜茂成 趙國琦,2,3*

(1.揚州大學 動物科學與技術學院，江蘇 揚州 225009；2.揚州大學 農業(yè)科技發(fā)展研究院，江蘇 揚州 225009；3.揚州大學 教育部農業(yè)與農產品安全國際合作聯(lián)合實驗室，江蘇 揚州 225009；4.常熟市海虞動物防疫站，江蘇 常熟 215500)

短鏈脂肪酸(Short chain fatty acid, SCFAs)是瘤胃內通過厭氧細菌發(fā)酵日糧產生的碳原子數(shù)為1～6的有機脂肪酸，主要包括乙酸、丙酸和丁酸，約占總揮發(fā)性脂肪酸95%[1]。SCFAs可部分代謝為酮體和乳酸，也可作為瘤胃上皮細胞的能量來源，反芻動物對SCFAs的依賴可以達到能量需求的70%[2]。G-蛋白偶聯(lián)受體41(G-protein-coupled receptor 41, GPR41)和GPR43已經被證明是SCFAs的受體[3]。GPR41和GPR43在各個組織中均有表達， GPR41在脂肪細胞中表達最高，GPR43在免疫細胞中表達最高[4]。并且GPR41和GPR43已經在奶牛不同的組織中被鑒定，在奶牛瘤胃上皮細胞(BRECs)中GPR41的表達量高于GPR43[5]。GPR41和GPR43都可以與G蛋白家族的Gi/o蛋白和Gq蛋白偶聯(lián)，從而增加細胞內鈣離子濃度和降低cAMP濃度[7]。GPR41主要與Gi/o蛋白偶聯(lián)激活信號傳導系統(tǒng)，而GPR43主要與Gq蛋白偶聯(lián)激活信號傳導系統(tǒng)[8-9]。

鈣離子參與機體的各項生理活動，不僅可以維持細胞膜兩側的生物電位，正常的神經傳導功能，正常的肌肉伸縮與舒張功能以及神經-肌肉傳導功能等，還可以發(fā)揮某些激素的作用機制。細胞內的Ca2+濃度可以通過“G蛋白偶聯(lián)-PIP2-1,4,5-三磷酸肌醇(IP3)”信號途徑來調節(jié)[10]。磷脂酶C(PLC)和蛋白激酶C(PKC)是Ca2+信號通路中引起級聯(lián)反應的關鍵分子[11]。PLCL1、PLCE1和PLCB2是PLC的3個家族，PKCB和PKCG是PKC的2種亞類。

在重組表達的GPR41或GPR43 CHO細胞中，SCFAs可以促進IP3水平的上升以及cAMP含量的下降，并且還會導致MAPK的活化和Ca2+的釋放[4]。SCFAs刺激奶牛乳腺上皮細胞(BMECs)后，在2～4 s內誘導細胞內Ca2+濃度增加，60 s內可以達到最大值。研究表明SCFAs是通過與GPR41、GPR43結合和活化而參與BMECs中的信號傳導[12]。此外，SCFAs可能通過GPR41和GPR43調節(jié)動物的神經系統(tǒng)。如丙酸可通過GPR41加強交感神經外流，但是在抑制GPR41的情況下丙酸并沒有加強交感神經的活性。經過siRNA試驗證明，交感神經的激活是通過GPR41介導的[13]。有研究表明，奶牛瘤胃上皮細胞(BRECs)在缺乏SCFAs的條件下，GPR41不能被表達[14]，SCFAs對BRECs 的Ca2+信號通路調控研究尚未有相關報道。因此，本研究旨在探討SCFAs對瘤胃上皮細胞的Ca2+信號通路相關分子的表達以及細胞內Ca2+濃度的影響，為進一步探究SCFAs對各種細胞Ca2+信號通路的影響提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

DMEM高糖培養(yǎng)基、澳洲胎牛血清、非必需氨基酸(NEAA)、磷酸鹽緩沖液(PBS)和胰蛋白酶(Gibco，美國)；乙酸、丙酸、丁酸、青霉素、鏈霉素、L-谷氨酰胺溶液和乙二胺四乙酸(EDTA)(Sigma,美國)；PrimeScriptTMRT Master Mix和SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ(TaKaRa，中國)；熒光定量96孔板和8連管(Bio-rad，美國)；總RNA提取試劑盒(Tiangen，中國)；Fluo-4/AM(Beyotime，中國)；FACS LSRFortessa流式細胞分析儀(BD，美國)；試驗所用野生型BRECs和通過CRISPR/Cas 9系統(tǒng)敲除GPR41的BRECs均由揚州大學動物培養(yǎng)物保藏與應用研究所(IACCA)提供[15]。

1.2 試驗方法

1.2.1試驗設計

試驗分為3個處理組，每個處理有3個重復，第1組為正常野生型瘤胃上皮細胞；第2組為培養(yǎng)基中含20 mmol/L SCFAs野生型瘤胃上皮細胞；第3組為培養(yǎng)基中含20 mmol/L SCFAs且通過CRISPR/Cas 9系統(tǒng)敲除GPR41基因的瘤胃上皮細胞。放置37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中。24 h之后，消化并收集細胞進行RNA提取。20 mmol/L SCFAs組成：12 mmol/L 乙酸、5 mmol/L丙酸和3 mmol/L丁酸。

1.2.2總RNA提取

按照總RNA提取試劑盒(Tiangen，中國)提取總RNA。最后，取1 μL提取的樣品進行總RNA濃度和純度的測定。

1.2.3反轉錄成cDNA

按照Takara反轉錄試劑盒進行，整個過程在冰上操作。反轉錄體系為10 μL，反應條件：37 ℃ 15 min 和85 ℃ 5 s；PCR反應體系為20 μL，反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)，每個樣品都有3個重復。

1.2.4Real-time PCR

熒光定量PCR反應配置總體系為20.0 μL，其中SYBR?Premix Ex TaqTMⅡKit 10.0 μL；10 μmol/L 的PCR Forward primer和PCR Reverse Primer各0.8 μL；Water PCR grade 6.4 μL；cDNA 2.0 μL。引物詳情見表1。反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)，每個樣品都有3個重復。計算方法按照2-ΔΔCT。

表1 熒光定量PCR引物Table 1 Reverse-transcription PCR primers

1.2.5細胞內游離鈣離子濃度的測定

待接種細胞培養(yǎng)24 h后，第2和第3處理組分別加20 mmol/L SCFAs作用2 min。收集3組細胞，加Fluo-4/AM(終濃度2.5 μmol/L)37℃避光孵育30 min進行熒光探針裝載，隨后PBS漂洗2次，流式細胞儀檢測。激發(fā)波長為494 nm，發(fā)射波長為516 nm，檢測的平均熒光強度來表示細胞內Ca2+濃度。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

結果采用“平均數(shù)±標準差”表示。運用SPSS 16. 0統(tǒng)計軟件中的One-Way ANOVA模塊進行單因素方差分析，顯著性檢驗應用LSD法。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示極顯著差異。

2 結果與分析

2.1 SCFAs對BRECs中PLC表達的影響

采用qRT-PCR分別檢測PLCL1、PLCE1和PLCB2在不同處理的BRECs中的表達變化，結果見圖1。在缺乏SCFAs的條件下，PLCB2幾乎不被表達；添加20 mmol/L SCFAs之后，PLCB2被極顯著激活(P<0.01)，PLCL1和PLCE1表達量上調,差異不顯著(P>0.05)。與添加SCFAs的野生型BRECs相比，敲除GPR41基因之后，PLCL1的表達量有下調的趨勢(P>0.05)，而PLCE1和PLCB2的表達量極顯著增加(P<0.01)。

WT代表野生型BRECs；GPR41KO代表通過CRISPR/Cas 9系統(tǒng)敲除GPR41；數(shù)據(jù)標注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。WT stands for wild-type BRECs. GPR41KO stands for knocking out GPR41 through the CRISPR/Cas 9 system. Data annotations with different lowercase letters mean significant difference (P<0.05). The same below.圖1 SCFAs對BRECs中PLC的mRNA表達影響Fig.1 Effects of SCFAs on the abundance of PLC mRNA in the BRECs

2.2 SCFAs對BRECs中PKC表達的影響

PKCB和PKCG在不同處理的BRECs中的表達見圖2。與野生型相比，敲除GPR41之后，添加SCFAs可以上調PKCB和PKCG的表達量，但是差異不顯著(P>0.05)。

2.3 SCFAs對BRECs中IP3R1表達的影響

由圖3可知，促進內質網(wǎng)鈣庫釋放的分子IP3R1在SCFAs誘導下，其mRNA表達量被顯著上調(P<0.05)；與野生型BRECs比，敲除GPR41之后，添加SCFAs,IP3R1的mRNA表達量顯著下調(P<0.05)。

(a) SCFAs對PKCB的mRNA表達影響;(b) SCFAs對PKCG的mRNA表達影響。(a) Effects of SCFAs on the abundance of PKCB mRNA; (b) Effects of SCFAs on the abundance of PKCG mRNA.圖2 SCFAs對BRECs中PKC的mRNA表達影響Fig.2 Effects of SCFAs on the abundance of PKC mRNA in the BRECs

圖3 SCFAs對IP3R1的mRNA表達影響Fig.3 Effects of SCFAs on the abundance of IP3R1 mRNA

2.4 SCFAs對BRECs中Ca2+濃度的影響

從圖4可知，在野生型BRECs內Ca2+濃度在SCFAs刺激后提高了21%，但差異不顯著(P>0.05)；與野生型BRECs比，敲除GPR41之后，添加20 mM SCFAs細胞內Ca2+濃度降低了15%，但差異不顯著(P>0.05)。

3 討 論

細胞內鈣離子濃度的變化對細胞代謝和細胞增殖中的信息傳遞有非常重要的意義。細胞內鈣信號是免疫細胞激活的關鍵因素，當抗原受體被觸發(fā)時，鈣從細胞外流入細胞內[16]。Kimura等[17]研究發(fā)現(xiàn)，圍產期奶牛單核細胞內鈣儲量較低，導致免疫細胞激活信號下鈣離子的釋放變弱。SCFAs是反芻動物體內主要的能量來源，并且可以調節(jié)瘤胃上皮細胞生長、瘦素水平、胰島素分泌和免疫應答過程[18-19]。SCFAs還可以刺激交感神經系統(tǒng)的激活，促進機體能量消耗[13]。GPR41和GPR43已經被證明是SCFAs的受體，奶牛瘤胃上皮細胞中GPR41的表達量高于GPR43[5]。有研究表明，添加20 mmol/L SCFAs和40 mmol/L SCFAs可以顯著增加BRECs中GPR41的表達量[6]，而缺乏SCFAs的條件下，GPR41并不能夠被表達[14]。因此，本試驗通過在野生型瘤胃上皮細胞和敲除GPR41之后的瘤胃上皮細胞中添加SCFAs來檢測Ca2+信號通路中關鍵分子的表達量以及細胞內Ca2+濃度的變化。

PLC和PKC是Ca2+信號通路中引起級聯(lián)反應的關鍵分子。IP3R是促進內質網(wǎng)鈣庫釋放的受體[11]。qRT-PCR結果表明，在缺乏SCFAs時，PLCB2幾乎不表達，但是添加20 mmol/L SCFAs后顯著被激活，并且PLCE1和PLCL1表達量也有所提高，暗示PLC進一步將IPI2分解為二酰甘油(DAG)和三磷酸肌醇(IP3)。IP3R是IP3受體，與IP3結合之后誘導其表達。因此，添加20 mmol/L SCFAs之后，IP3R1能極顯著激活。IP3R的表達介導內質網(wǎng)釋放Ca2+，添加SCFAs之后，細胞內Ca2+濃度提高了21%。SCFAs刺激BMECs之后誘導細胞內Ca2+濃度增加[12]。Yonezawa等[20]研究表明，GPR41和GPR43被SCFAs激活后，誘導細胞內鈣離子濃度上升并且不受百日咳毒素的阻斷作用。丁酸與大鼠的腦垂體細胞在一起孵育后可以增加細胞內Ca2+的濃度，這主要是通過GPR41和GPR43信號通路實現(xiàn)的[21]。SCFAs促進Ca2+濃度的升高與本研究結果一致。細胞內游離的Ca2+進一步增加了PKC活化，添加SCFAs之后，PKCB和PKCG的表達量有所提高，和Ca2+濃度的變化趨勢相同。PKC進一步激活MAPK信號通路，引起級聯(lián)反應，進行細胞信號轉導。由此可以看出SCFAs激活細胞內Ca2+信號通路與細胞內MAPK信號通路是相輔相成的。丁酸不僅誘導細胞內Ca2+濃度增加，而且也誘導GPR41和GPR43增加。在生長釋放素激素的作用下，GPR43基因沉默后，細胞內的Ca2+濃度并沒有改變[12]。

為探究SCFAs對BRECs中Ca2+信號通路的調控機制，本文通過由揚州大學動物培養(yǎng)物保藏與應用研究所提供的CRISPR/Cas 9系統(tǒng)敲除GPR41基因的BRECs來進行深入研究。敲除BRECs中的GPR41基因,添加SCFAs之后，GPR41的表達量顯著下降，表明GPR41的一個等位基因被成功地敲除[11]。本試驗結果顯示，添加20 mmol/L SCFAs之后，與野生型BRECs比，敲除GPR41顯著上調了PLCB2和PLCE1的表達量；PLCL1的表達量降低，PKCB和PKCG的表達量升高，但是均無顯著差異。由此可以看出SCFAs不是通過GPR41加強PLCB2、PLCE1、PLCL1、PKCB和PKCG的表達。相反，IP3R1的表達量被顯著下調，該結果表明SCFAs對IP3R1的調控是通過GPR41實現(xiàn)的。而且本試驗細胞內Ca2+濃度降低了15%，是由于內質網(wǎng)上IP3R1的低表達抑制了內質網(wǎng)上鈣庫中Ca2+的釋放。

4 結 論

SCFAs可以通過激活其受體GPR41來調控BRECs上皮細胞IP3R1、PLCE1和PLCB2的表達，及細胞內Ca2+釋放，以進一步激活Ca2+信號通路。