浮萍對Cu2+脅迫的反應機理研究

韓雪靜亞

（南京師范大學中北學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212300）

重金屬在水體中不能被微生物降解，只能以不同的價態(tài)在水和生物之間轉移，當在水體中積累到一定的濃度時，就會對水生動植物系統(tǒng)造成嚴重危害。銅是植物生長必需的營養(yǎng)元素，在生物體內，多以銅離子或銅蛋白形式存在，在植物葉片中，葉綠體內的銅含量最高。銅是一種廣泛存在于水體中的過渡金屬，雖然濃度不高，但由于其毒性效應明顯，受到了環(huán)境科學界的廣泛關注。因此，本研究以Cu2+為脅迫因子，以浮萍為材料，研究了不同質量濃度Cu2+對葉綠素含量、可溶性蛋白含量、丙二醛濃度和保護酶活性的影響，揭示Cu2+對水生植物的毒害機理。

1 材料與方法

1.1 材料

浮萍（Lemna minorL.）是浮萍科浮萍屬漂浮植物。實驗材料采自南京水域，后移植于南京師范大學中北學院實驗室塑料盆中培養(yǎng)。

1.2 材料的培養(yǎng)

2020年10月初，將實驗材料置于實驗室內的塑料盆中，用自來水馴化5天。選取生長狀況較為一致的植株，分別用含有質量濃度為0、0.5、1.0、1.5、2.5 mg/L的Cu2+（以無水硫酸銅配制，質量濃度以純Cu2+計算）的1/10Hoagland’s營養(yǎng)液處理。第5天取相同部位的葉片，用去離子水洗凈擦干，測定其生理生化指標。

1.3 生理生化指標

葉綠素含量采用丙酮法測定，可溶性蛋白含量選用考馬斯亮藍G-250法測定，MDA濃度按照硫代巴比妥酸的方法測定，SOD活性選擇NBT光化學還原法測定。POD活性測定采用愈創(chuàng)木酚法。

1.3.1 葉綠素含量的測定

采取丙酮法，將葉片用80%的丙酮研磨成勻漿，用漏斗過濾，分別在652、663和645 nm處測定吸光度。

1.3.2 可溶性蛋白含量的測定

選用考馬斯亮藍G-2 5 0法測定，以牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）為標準蛋白。在595 nm處測定吸光度。

1.3.3 丙二醛（MDA）含量的測定

葉片膜脂質過氧化的程度用丙二醛（MDA）的含量來表示。MDA含量用硫代巴比妥酸（TBA）比色法測定。

1.3.4 超氧化物歧化酶（SOD）活性的測定

取鮮重0.5 g的葉片，加入5 mL濃度為50 mmoL/L的磷酸緩沖溶液，在冰浴下研磨成勻漿并離心，上清液用于酶活性分析。

1.3.5 過氧化物酶（POD）活性的測定

參照愈創(chuàng)木酚法，在470 nm處每隔10 s讀一次數(shù)。以每分鐘吸光度的變化值表示酶活性大小。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實驗均重復3次。將各生理生化指標與處理濃度作相關性分析（相關系數(shù)為r），處理組與對照組之間的差異顯著性分析由SPSS統(tǒng)計軟件完成，其中，P＜0.05和P＜0.01分別表示顯著差異和極顯著差異。

2 結果與分析

2.1 Cu2+對浮萍葉片總葉綠素含量的影響

由實驗結果可知，浮萍葉片葉綠素含量隨著Cu2+質量濃度的升高而下降。在Cu2+質量濃度為0.5 mg/L時，葉綠素含量下降了65.93%，葉綠素a/b含量達到了最低值，尤其是葉綠素a的含量急劇降低。

2.2 Cu2+對浮萍葉片可溶性蛋白含量的影響

隨著Cu2+質量濃度的升高，浮萍葉片可溶性蛋白含量逐漸下降。其中，在Cu2+質量濃度為1.0 mg/L時，可溶性蛋白含量略微降低。當Cu2+質量濃度超過1.5 mg/L時，浮萍中的可溶性蛋白含量顯著下降。統(tǒng)計分析表明，可溶性蛋白含量與Cu2+質量濃度之間達到了極顯著負相關（r=-0.933 6，P＜0.01）。

2.3 Cu2+對浮萍葉片丙二醛（MDA）濃度的影響

MDA濃度隨Cu2+質量濃度的變化如圖1所示，隨著Cu2+質量濃度的不斷升高，MDA的濃度也不斷增加。在Cu2+質量濃度為2.5 mg/L時，浮萍葉片的MDA濃度達到最高。統(tǒng)計分析表明，MDA的濃度與Cu2+質量濃度呈極顯著正相關（r=0.971 0，P＜0.01）。

圖1 Cu2+質量濃度對浮萍葉片丙二醛（MDA）濃度的影響

2.4 Cu2+對浮萍葉片超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響

SOD活性隨Cu2+質量濃度的變化如圖2所示，隨著Cu2+質量濃度的增加，SOD活性先上升后下降，在Cu2+質量濃度為1.0 mg/L時達到最大值。統(tǒng)計分析表明，對照組與實驗組之間的SOD值達到了極顯著差異（P＜0.01）。

圖2 Cu2+質量濃度對浮萍葉片超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響

2.5 Cu2+對浮萍葉片過氧化物酶（POD）活性的影響

隨著Cu2+質量濃度的不斷升高，POD活性也呈先上升后下降的趨勢，在Cu2+質量濃度為1.0 mg/L時達到峰值，比對照組上升了63.79%。

3 討論

葉綠素是植物光合作用的主要色素，其含量與植物光合作用水平有著密切的關系。銅參與光合作用的電子傳遞和光合磷酸化及多種葉綠體酶的合成，對植物葉綠體含量和光合作用有著直接影響[1]。本實驗采用2.5 mg/L Cu2+處理時，葉綠素含量降到最低。

可溶性蛋白質的含量能反映植物生理活動的旺盛程度。研究發(fā)現(xiàn)，在不同質量濃度的Cu2+處理下，浮萍葉片的可溶性蛋白含量逐漸降低，在低質量濃度Cu2+（0.5 mg/L）下下降緩慢；在高質量濃度Cu2+（≥1.5 mg/L）下下降明顯。這可能是因為Cu2+在細胞內提高了蛋白水解酶的活性，加快了蛋白質的水解[2]。

丙二醛是最常見的膜脂過氧化產(chǎn)物，從膜上產(chǎn)生的位置釋放后，可以與蛋白質等生物大分子發(fā)生反應，從而改變生物大分子的結構，甚至使其喪失功能。浮萍中MDA濃度隨著Cu2+質量濃度的上升而增加，說明膜脂過氧化程度加劇。

超氧化物歧化酶普遍存在于植物體內，是一種清除超氧陰離子自由基的酶，其與過氧化物酶協(xié)同作用并預防活性氧或其他過氧化物自由基對細胞膜系統(tǒng)造成傷害。Cu2+脅迫可打破三者的平衡，使植物體內自由基含量上升。SOD和POD的活性都是先升后降，其活性的降低在一定程度上加劇了活性氧對膜的傷害，導致植物細胞損傷過大，保護能力下降，細胞結構及生理生化反應被破壞，最終加速了植物細胞的衰老和死亡[3]。

重金屬Cu2+對浮萍有明顯的毒害作用，會破壞植物正常的生理代謝，最終導致植物死亡。