L-谷氨酸對櫻桃番茄果實病程相關蛋白的影響

楊佳麗,王 樂,相玉婷,王 茜,王 愈

(山西農業大學食品科學與工程學院,山西太谷 030801)

作為呼吸躍變型果實,櫻桃番茄(SolanumlycopersicumL.)采后生理品質變化迅速,且因其營養豐富、含水量高,很容易遭受病原菌的侵染[1],尤其是由真菌引起的侵染性病害,是造成其損失的重要因素[2-3]。其中,由腐生型病原菌Alternariaalternata引起的黑斑病是引起番茄果實發生腐爛的重要病害[4]。因長期施用化學殺菌劑會對食品安全和環境帶來不容忽視的負面影響,當前利用誘導因子激發植物自身抗性已成為減少或替代化學殺菌劑的有效途徑[5-7]。

植物體內存有大量抗逆境的基因或蛋白,當受到外界環境刺激或脅迫時,會誘導啟動植物自身抗性相關基因或蛋白的表達,從而使其獲得對逆境的抗性[8-9]。已有研究顯示,病程相關蛋白(Pathogenesis-related proteins,PRs)是參與植物抗病性的一類重要物質[10]。PRs家族蛋白具有潛在的抑菌作用,直接或者間接的抑制病原菌的生長及傳播[11]。如PR2、PR5蛋白具有β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-glucanase,GLU)特性,PR3和PR4蛋白則具有幾丁質酶(chitinases,CHI)活性。因葡聚糖和幾丁質是病原真菌細胞壁的主要成分,GLU和CHI可通過催化這兩種物質的水解或通過釋放寡糖誘導植物抗性,有效抑制病原菌的侵染[12]。大量研究報道表明,利用拮抗菌或其它激發子誘導果實產生抗性的同時,GLU和CHI活性也顯著提高[13]。PR9蛋白則具有過氧化物酶(peroxidase,POD)活性,在植物體內POD一方面作為活性氧清除劑,與超氧化物歧化酶和過氧化氫酶組成了抗氧化酶保護系統,另一方面,參與合成細胞壁木質素,有效提高病原菌侵染宿主細胞時細胞壁的強度,在植物的防御反應中發揮重要的作用[14]。PR1蛋白一般認為是系統獲得性抗性(systemic acquired resistance,SAR)激活的標志蛋白[15]。PRs廣泛存在于各類植物中,不僅可由病蟲害誘導產生,也可被一些化學物質,如水楊酸、氨基酸衍生物等誘導合成,其在植物體內的積累已被認為是誘導抗性的重要生化機制之一[16]。

L-谷氨酸(以下簡稱“谷氨酸”)在生物體內氨基酸代謝中具有中心地位,參與合成多種與抗性密切相關的代謝物質,如精氨酸、脯氨酸和γ-氨基丁酸[17]。目前,已有研究報道了谷氨酸在植物響應非生物脅迫時發揮著重要作用,然而有關谷氨酸在參與響應病原菌侵染中的作用鮮有報道[18]。谷氨酸因其安全環保,生產、保存成本低,使用簡單等優點,成為一種具有廣闊應用前景的理想誘導因子。前期研究發現,谷氨酸作為外源激發子可有效抵御Penicilliumexpansum對梨果實的侵染[19]。為進一步明確谷氨酸對采后果實的抗性調控機制,本試驗擬以櫻桃番茄為研究對象,探究其對果實病程相關蛋白及其編碼基因表達的影響,為開發基于谷氨酸的綠色保鮮劑提供充分的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

櫻桃番茄 品種為“千禧”(SolanumlycopersicumL. cv. Qianxi),采收于山西太谷當地的溫室大棚,挑選無病蟲害侵染、無機械損傷、大小統一且均處以紅熟階段的果實;Alternariaalternata(CGMCC3.4578) 中國普通微生物菌種保藏管理中心;L-谷氨酸 分析純,上海阿拉丁生化科技股份有限公司,調整其溶液pH至7左右;幾丁質酶檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所;Trizlol試劑、PrimescriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒、SYBR? Premix Ex TaqTM試劑盒 日本TaKaRa公司。

Spectra max plus 384酶標儀 美國MD公司;NanoDrop l000分光光度計 美國Thermo公司;PTC-225型Thermal Cycler PCR儀 美國Bio-Rad公司;StepOne Real-Time PCR儀 美國ABI公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 病原菌孢子懸浮液制備 將病原菌A.alternata在PDA培養基上25 ℃條件下培養7～10 d后,將A.alternata孢子用無菌水洗出,而后用血球計數板方法調整孢子懸浮液至所需濃度。

1.2.2 體外實驗

1.2.2.1 谷氨酸對A.alternata生長的影響 將定量的A.alternata孢子懸浮液分別與不同濃度的谷氨酸溶液(0、10、100、1000 mg/L)混合1 min后,吸取100 μL混合液涂布在PDA表面,并將其置于25 ℃條件下培養72 h后統計每個平板中的菌落數。每個處理3個重復,每個重復不少于3個平板,統計結果單位用CFU/plate表示。

1.2.2.2 谷氨酸對A.alternata孢子萌發的影響 將谷氨酸溶液加入PDB培養基后使其最終濃度分別達到0、10、100和1000 mg/L,隨即接入最終濃度為105spores/mL的A.alternata孢子懸浮液,25 ℃條件下搖床震蕩培養24 h后,對至少100個孢子的萌發情況在顯微鏡下進行統計分析。每個處理3個重復,每個重復不少于3個樣品,平均孢子萌發率用%表示。

1.2.3 櫻桃番茄果實處理與取樣

1.2.3.1 谷氨酸誘導處理時間對櫻桃番茄果實黑斑病的影響 在大量預實驗和前期研究基礎上[19],繼續選用下述谷氨酸濃度和誘導時間開展后續試驗。將果實浸泡于0.1%次氯酸鈉2 min后,用水清洗干凈,晾干備用。番茄果實隨機分為2組:對照組浸泡于水10 min后取出晾干;谷氨酸處理組浸泡于谷氨酸溶液(100 mg/L)10 min后取出晾干。在25 ℃,相對濕度高于95%條件下分別誘導處理0、12、24和36 h后,在果實表面赤道部位制造1個傷口(直徑3 mm,深2 mm),隨即接入濃度為104spores/mL的A.alternata孢子懸浮液20 μL。將處理后的果實密封并置于恒溫恒濕箱內,定時觀察果實的發病情況,每個處理3個平行,每個平行25個果實。

1.2.3.2 取樣 為了測定果實的酶活性和基因表達量,將經過上述2個處理(對照組和谷氨酸處理組)的番茄置于恒溫恒濕條件下(25 ℃,相對濕度高于95%),分別于0、12、24、36和48 h切取果實表皮組織并立即用液氮冷凍,置于-80 ℃下保存備用。

1.2.4 指標測定

1.2.4.1 孢子萌發率的測定

1.2.4.2 果實發病率的測定

1.2.4.3 病程相關蛋白編碼基因表達豐度的測定 果實組織總RNA提取參照Luan等[20]的Trizol方法。通過PrimescriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒合成cDNA后,參照SYBR? Premix Ex TaqTM試劑盒說明,利用實時熒光定量PCR(RT-qPCR)方法測定病程相關蛋白編碼基因的表達量。目的基因引物設計利用Primer Premier 7.0軟件(PREMIER Biosoft International)進行,具體引物序列如表1所示,以LeActin為內參基因。基因的相對定量利用2-ΔΔCt方法計算[21]。當處理組目的基因轉錄水平為對照組的2倍及以上時,表示該基因上調表達;當處理組基因表達量為對照組的0.5倍以下時,則認為該基因下調表達。

表1 病程相關蛋白編碼基因引物序列Table 1 Primer sequences of PR genes

1.2.4.4 酶活性測定β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-glucanase,GLU)活性測定參照Zheng等[22]的方法,幾丁質酶(chitinases,CHI)活性利用南京建成生物工程研究所試劑盒測定,過氧化物酶(peroxidase,POD)活力依據Lurie等[23]的愈創木酚法測定。按照Bradford[24]方法檢測組織中蛋白質的含量。果實組織酶活性以每毫克蛋白中的酶活力表示,單位為U/mg。

1.3 數據處理

整個實驗至少重復2次,直到2次實驗結果保持一致。實驗數據利用SPSS/PC ver. II.x軟件進行鄧肯氏(Duncan’s)差異分析,P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 谷氨酸對病原菌A. alternata體外生長的影響

為進一步明確谷氨酸對病原菌的作用,研究了在體外條件下不同濃度谷氨酸對A.alternata生長的影響。結果如表2所示,在PDA培養基上,谷氨酸對病原菌的存活菌落數沒有產生明顯的影響;同時,在PDB培養條件下,各個濃度的谷氨酸對病原菌的孢子萌發也無顯著抑制效果。顯然,在本次試驗條件下,谷氨酸不會對病原菌A.alternata產生直接的抑制作用。

表2 谷氨酸對病原菌A. alternata在PDA和PDB培養基中生長的影響Table 2 Effect of glutamate on A. alternatasurvival in PDA and PDB

2.2 谷氨酸誘導處理時間對櫻桃番茄果實黑斑病的影響

如圖1所示,谷氨酸對番茄果實黑斑病的抑制效果與其誘導處理時間密切相關。當果實未經谷氨酸誘導直接接入病原菌A.alternata時,其發病率與對照組相比無明顯差異,即谷氨酸對番茄黑斑病并無直接抑制作用。然而當谷氨酸誘導時間延長至24和36 h時,果實的發病率顯著低于對照組,分別降低了約30.8%和29.5%。

圖1 谷氨酸誘導處理時間對番茄果實發病率的影響Fig.1 Effect of glutamate on disease incidence of tomato fruit 注:*表示對照組與處理組差異顯著(P<0.05)。

2.3 谷氨酸對病程相關蛋白編碼基因的影響

谷氨酸處理組的LePR1基因被迅速誘導表達,在12和24 h時,其轉錄水平分別為對照組的9.1倍和14.2倍(圖2A)。由圖2B所示,LePR5基因在被谷氨酸誘導處理24 h時上調表達約2.8倍。PRs家族中PR3和PR4具有幾丁質酶特性,結果顯示編碼幾丁質酶的基因LeCHI3和LeCHI9變化規律一致,尤其是在48 h時,谷氨酸處理組LeCHI3轉錄水平為對照組的3.7倍(圖2C)。PR9具有過氧化物酶活性,RT-qPCR檢測結果表明,LePOD與LePR1表達趨勢類似,可被谷氨酸快速激活,尤其在12 h時基因相對表達量約為對照組的16.0倍(圖2E)。

圖2 谷氨酸對櫻桃番茄果實PRs基因的影響Fig.2 Effect of glutamate on the gene expression of PRs in cherry tomato fruit注:*表示目的基因顯著上調表達，P<0.05(Fold change≥2)。

2.4 谷氨酸對β-1,3-葡聚糖酶、幾丁質酶和過氧化物酶活性的影響

病程相關蛋白PRs是參與植物誘導抗性的重要機制之一,圖3顯示了經谷氨酸處理后,β-1,3-葡聚糖酶、幾丁質酶和過氧化物酶等在果實組織內的變化趨勢。由圖3A可知,對照組在整個貯藏期間GLU無明顯變化,而果實經谷氨酸處理12 h后,GLU活性逐漸上升,24 h時達到酶活高峰,約為對照組的1.3倍。CHI顯示了與GLU相近的變化規律,谷氨酸處理果實后可快速提高CHI活性,同樣在24 h時達到峰值(圖3B)。谷氨酸處理組POD活性整體呈先升后降趨勢,至24 h時達到峰值,而后雖然開始下降,但其酶活性依然高于對照組(圖3C)。

圖3 谷氨酸對櫻桃番茄果實GLU,CHI和POD活性的影響Fig.3 Effect of glutamate on the activities of GLU,CHI and POD in cherry tomato fruit

3 討論與結論

本研究中,谷氨酸作為外源因子可以有效抑制由A.alternata引起的番茄黑斑病,且其抑制效果與對果實的誘導處理時間密切相關。當番茄未經谷氨酸誘導時,其對A.alternata的侵染無任何抵御能力,然而隨著誘導時間的增加,尤其是達到24 h及以上時,果實對黑斑病的防御能力顯著提升。事實上,在外源因子的激發下,果實誘導抗性的形成通常需要一定的時間響應[25]。如利用外源草酸處理甜瓜時,當誘導時間達到48 h以上才可以有效啟動果實自身抗性抵御Trichotheciumroseum的侵染[26]。同時,體外試驗結果顯示谷氨酸對A.alternata在PDA上的生長以及在PDB中的孢子萌發狀態并無任何影響。以上結果暗示,谷氨酸有效抵御病原菌的侵染可能是通過誘導提高果實自身抗性,而非直接的抑菌作用。

病程相關蛋白被認為是植物誘導抗性的重要生化機制之一,可以直接或者間接的抑制病原菌的生長、傳播,具有潛在的抑菌活性。大量研究表明,PR1蛋白是植物誘導系統獲得性抗性激活的標志蛋白,并與水楊酸信號路徑緊密相關[27]。本研究結果顯示,編碼PR1蛋白的LePR1基因可被谷氨酸快速強烈誘導表達,這與Kadotani等[28]報道結果類似,當用谷氨酸處理過水稻根部后,不論是其根部組織還是葉片組織,與水楊酸相關的基因,如OsPR1b基因顯著上調表達。葡聚糖和幾丁質是真菌細胞壁的主要成分,具有β-1,3-葡聚糖酶和幾丁質酶特性的PRs可通過分解這兩種物質破壞病原真菌細胞壁的結構。已有證據顯示,PR5蛋白可特異性地與β-1,3-葡聚糖結合,具有β-1,3-葡聚糖酶活性[29]。

本研究中,編碼PR5蛋白的LePR5基因和β-1,3-葡聚糖酶活性均可被谷氨酸誘導激活。同時,谷氨酸處理對果實中的幾丁質酶及其編碼基因LeCHI3和LeCHI9也有類似的誘導作用。另外,PR9蛋白具有過氧化物酶活性,可通過催化合成木質素強化細胞壁抵御病原菌的侵染。谷氨酸處理不僅誘導LePOD基因上調,還使得POD活性大大提高。葛永紅等[30]利用苯丙噻重氮處理蘋果后發現大大促進了果實體內病程相關蛋白(如β-1,3-葡聚糖酶,幾丁質酶和過氧化物酶)的積累,這與本研究結果類似。由上述結果推斷,谷氨酸對A.alternata的作用機制可能與其誘導了番茄果實體內的病程相關蛋白有關。

綜上,谷氨酸對病原菌A.alternata沒有直接的抑制作用,其防御果實病害的機制可能是通過誘導提高番茄果實自身的抗性。谷氨酸處理可通過誘導編碼病程相關蛋白的基因上調,如LePR1、LePR5、LeCHI3、LeCHI9和LePOD,并提高β-1,3-葡聚糖酶、幾丁質酶和過氧化物酶的活性,最終增強果實抵御病原菌的能力。然而,谷氨酸作為新型的化學誘導因子,其誘導抗性機制還有待后續進一步研究,以為其商業化提供堅實的理論基礎。