棉花連作土壤中二甲戊靈降解優(yōu)勢(shì)菌的分離及其降解能力

韓亞杰1,王丹琪1,包慧芳

(1.石河子大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,新疆石河子 832003;2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所,新疆烏魯木齊 830091)

施加化肥和農(nóng)藥是保障農(nóng)業(yè)增產(chǎn)增收的有效措施,預(yù)計(jì)2020年全球農(nóng)藥市場(chǎng)規(guī)模可達(dá)600億美元以上[1]。隨著人們環(huán)保意識(shí)的增強(qiáng),農(nóng)藥的毒性問(wèn)題和殘留問(wèn)題越來(lái)越受到關(guān)注。農(nóng)藥可以導(dǎo)致水生生物中毒和死亡,其中殺蟲(chóng)劑和除草劑是這類事故的主要“元兇”[2]。1992年,美國(guó)地下水中含50多種農(nóng)藥,其中涕滅威的濃度高達(dá)515 ng/L,1994年地下水中可檢測(cè)的農(nóng)藥品種上升至157種,并且在湖泊中的魚(yú)類體內(nèi)檢測(cè)到滴滴涕、艾氏劑等有毒農(nóng)藥[3]。自上世紀(jì)中葉開(kāi)始,農(nóng)藥降解菌陸續(xù)被分離,對(duì)其降解代謝途徑及關(guān)鍵降解基因也進(jìn)行了較為詳細(xì)的研究。研究發(fā)現(xiàn)真菌尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum),米曲霉菌(Aspergillusoryzae),香菇(Lentinulaedodes),短密青霉(Penicilliumbrevicompactum)和蠟蚧菌(Lecanicilliumsaksenae)可以在液體培養(yǎng)中對(duì)特丁津和二甲戊樂(lè)靈進(jìn)行生物降解[4]。

除草劑二甲戊靈上市已經(jīng)40年,主要應(yīng)用于棉花、玉米和煙草的田間除草劑[5-7],在新疆應(yīng)用較為廣泛。二甲戊靈的化學(xué)結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜,施用后在土壤中的吸附性強(qiáng),而且很難被解吸,持效期長(zhǎng)。除草劑二甲戊靈已經(jīng)被美國(guó)環(huán)境保護(hù)署EPA正式列入持久性生物累積性有毒物質(zhì)(PBT)名單,它可引發(fā)小鼠罹患甲狀腺濾泡細(xì)胞腺瘤,對(duì)水體里的魚(yú)類和無(wú)脊椎生物高毒,同時(shí)也是人類潛在的致癌物[8-9]。近些年,國(guó)內(nèi)外報(bào)道了利用微生物或者是微生物產(chǎn)生的酶去降解二甲戊靈,主要集中在土壤中二甲戊靈降解菌的分離、純化,涵蓋了細(xì)菌和真菌[10-14],但是關(guān)于酵母菌降解二甲戊靈的報(bào)道較少。由于酵母菌具有耐滲透壓、耐酸以及高的代謝效率等特點(diǎn),因此在降解有機(jī)污染物方面同樣具有重要的作用。人們還發(fā)現(xiàn)酵母菌在分解有機(jī)污染物時(shí)會(huì)產(chǎn)生豐富的酵母蛋白,即美化了環(huán)境又可以對(duì)代謝產(chǎn)生的蛋白進(jìn)行綜合利用[15]。周江亞等[16]分離了1株降解苯酚的熱帶假絲酵母菌,對(duì)苯酚的降解率高達(dá)99.10%。劉斌斌等[17]分離了一株對(duì)甲胺磷具有極高降解活性的魯氏酵母菌(Saccharomycesrouxii)WY3后發(fā)現(xiàn),經(jīng)過(guò)WY3處理12 h后的樣品未檢出甲胺磷。肖琳等[18]利用酵母菌降解苯二甲酸工業(yè)廢水,對(duì)酵母菌代謝產(chǎn)生的細(xì)胞蛋白進(jìn)行小鼠的急性毒性、蓄積毒性和致突變?cè)囼?yàn)分析,研究顯示小鼠內(nèi)臟未見(jiàn)病變,同時(shí)發(fā)現(xiàn)小鼠很喜歡吃酵母菌代謝產(chǎn)生的細(xì)胞蛋白。由此得知,酵母菌對(duì)有機(jī)污染物的生物降解是一種可持續(xù)發(fā)展的技術(shù)手段,其可將有機(jī)污染物轉(zhuǎn)化為細(xì)胞蛋白,優(yōu)越性可見(jiàn)一斑。

本文從棉花連作并常年施加除草劑二甲戊靈的土壤中分離了5株降解二甲戊靈的優(yōu)勢(shì)菌,并研究了降解能力最高菌株XSP6的降解性能,以期對(duì)農(nóng)藥污染的水體和土壤生物修復(fù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

二甲戊靈標(biāo)準(zhǔn)品 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;33%的施田補(bǔ)乳油 江蘇豐山集團(tuán)有限公司;石油醚 分析純,天津永晟精細(xì)化工有限公司;無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基 NaNO33 g,K2HPO41 g,KCl 0.5 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,FeSO40.01 g,按需加入不同質(zhì)量的蔗糖,1000 mL去離子水,自然pH,高壓滅菌;PDA培養(yǎng)基馬鈴薯200 g,蔗糖20 g,1000 mL自來(lái)水,自然pH,高壓滅菌。

MLS-3750型高壓滅菌鍋 日本三洋公司;SW-CJ-ZFD型超凈工作臺(tái) 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;LRH-150型恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;ZQZY-70BS型恒溫振蕩器 上海知楚儀器有限公司;5418R型冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司;R-210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士BUCHI科技有限公司;LC-10A型高效液相色譜儀 日本島津;Axio Observer型熒光倒置顯微鏡 德國(guó)ZEISS公司;FR-980型凝膠成像儀 上海復(fù)日科技有限公司;PCR擴(kuò)增儀 BIO-RED伯樂(lè);UV-2100紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 優(yōu)尼柯(上海)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 二甲戊靈降解菌的富集篩選 配制土壤稀釋液(土壤∶無(wú)菌水=1∶10),28 ℃振蕩培養(yǎng)30 min,靜止后吸取上層清液,按著5%的量接種到含二甲戊靈100 mg/L的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液中,28 ℃振蕩培養(yǎng)5 d取適量富集液接種到含二甲戊靈200 mg/L的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液中,如此轉(zhuǎn)接直至二甲戊靈的濃度達(dá)到4500 mg/L。取富集后的菌液利用稀釋平板涂布法獲得單菌落,再經(jīng)過(guò)三次劃線得到純菌,以15%甘油管保存在-80 ℃冰箱。

1.2.2 二甲戊靈降解優(yōu)勢(shì)菌的復(fù)篩 挑選5株生長(zhǎng)良好的酵母菌分別接種至10 mL無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液,控制初始二甲戊靈濃度為300 mg/L、蔗糖含量為0.5%,分裝至錐形瓶中,再向每個(gè)錐形瓶中加入培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌懸液0.8 mL,置恒溫振蕩培養(yǎng)箱28 ℃、120 r/min培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后加入5 mL飽和NaCl溶液,用30 mL石油醚萃取,萃取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮,吹干后加入3 mL色譜純甲醇溶解定容,經(jīng)0.22 μm尼龍(NY)濾膜過(guò)濾,高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量。

1.2.3 菌株形態(tài)觀察和生理生化鑒定 使用顯微鏡對(duì)分離菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。同時(shí)進(jìn)行菌株的生理生化測(cè)定[1,3]。

1.2.4 26S rRNA鑒定 按照Ezup柱式酵母基因組DNA抽提試劑盒提取酵母菌XSP6的基因組DNA。以酵母菌XSP6的基因組DNA為模板,利用通用引物NL1-F和NL1-R對(duì)菌株的26S rRNA的基因片段進(jìn)行擴(kuò)增,正向引物NL1-F:5′-GCATATCAATAA GCGGAGGAAAAG-3′,反向引物NL1-R:5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′。酵母菌26S rRNA基因基因擴(kuò)增體系:0.5 μL基因組DNA;2.5 μL 10×Buffer;1 μL dNTPs(2.5 mmol/L);0.5 μL引物NL1-F(10 μmol/L);0.5 μL引物NL1-R(10 μmol/L);0.2 μL Easy-Taq DNA polymerase(5 U/μL);25 μL ddH2O。PCR 擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)為:94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性45 s,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min,4 ℃終止反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),電泳條件150 V、100 mA。PCR產(chǎn)物由生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST(Basic Local Alignment Search Tool,http://www.ncbi. nlm. nih. gov/BLAST)搜索[19],并與數(shù)據(jù)庫(kù)中已上傳的26S rRNA基因序列進(jìn)行同源性對(duì)比,并利用Mega 5.0進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.2.5 酵母菌XSP6降解率的測(cè)定

1.2.5.1 二甲戊靈濃度 調(diào)整二甲戊靈濃度分別為50、150、300 mg/L,分裝于錐形瓶后接種培養(yǎng),5 d后取出無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基,使用石油醚萃取降解產(chǎn)物,最后以HPLC法測(cè)定并計(jì)算農(nóng)藥的降解率。

1.2.5.2 接種量 根據(jù)上述試驗(yàn)的結(jié)果選擇適宜的二甲戊靈濃度,調(diào)整接種量分別在1%、1.5%、2.5%、5%,5 d后取出無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基,使用石油醚萃取降解產(chǎn)物,最后以HPLC法測(cè)定并計(jì)算農(nóng)藥的降解率。

1.2.5.3 外加碳源 根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果選擇適宜的二甲戊靈濃度和接種量,配制含碳源蔗糖0.5%、1.0%、1.5%、2.0%不同濃度的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液,5 d后取出無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基,使用石油醚萃取降解產(chǎn)物,最后用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量,同時(shí)計(jì)算農(nóng)藥的降解率。

1.2.6 降解率的測(cè)定 高效液相色譜條件:C8色譜柱(Waters公司),甲醇∶水(85∶15)為流動(dòng)相,流速為1 mL·min-1,柱箱溫度為30 ℃,檢測(cè)波長(zhǎng)為238 nm[20]。本實(shí)驗(yàn)采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量。配制標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度為50、100、150、300、500 mg/L,用色譜純甲醇定容至10 mL的容量瓶中,混勻;經(jīng)0.22 μm尼龍(NY)濾膜過(guò)濾,高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定。以質(zhì)量濃度x(mg/L)為橫坐標(biāo),峰面積y為縱坐標(biāo),得到線性回歸方程y=48240x+580356.9233。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Origin軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與繪圖,所有樣品均測(cè)量3次,取平均值并給出標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種的富集分離

富集培養(yǎng)法是一種有效且有用的分解細(xì)菌的方法,其能夠以較高的效率分解殺蟲(chóng)劑[21]。本實(shí)驗(yàn)以棉花連作并常年施用二甲戊靈的土壤作為菌種來(lái)源,經(jīng)過(guò)富集培養(yǎng)的方法,平板涂布后獲得單菌,挑取單菌平板劃線三次最后得到單菌,分離獲得20株單菌,選取生長(zhǎng)良好的5株菌,分別命名為YL128、YL127、YL125、YLW和XSP6,篩選的這5株菌進(jìn)行后續(xù)的降解能力復(fù)篩。研究報(bào)告顯示,FLN-7可以降解除蟲(chóng)脲[22],Aspergillussojaestrain JPDA1能夠降解久效磷[23],Paracoccussp.QCT6可降解嗪草酮[24]。Ni等發(fā)現(xiàn),在二甲戊靈作為碳源的情況下,Paracoccussp.可以有效降解二甲戊靈[25]。朱魯生在二甲戊靈降解細(xì)菌HB-7的實(shí)驗(yàn)證實(shí),菌株HB-7在以高濃度二甲戊靈為唯一碳源的平板上生長(zhǎng)良好,而且降解率高[26]。

2.2 酵母菌降解能力復(fù)篩

YL128、YL127、YL125、YLW和XSP6對(duì)二甲戊靈的降解率見(jiàn)圖1。從圖1中可以看出,雖然本實(shí)驗(yàn)篩選的5株菌均可耐受高濃度的二甲戊靈,但是在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，這5株菌對(duì)農(nóng)藥的降解能力是不同的,其中酵母菌XSP6在5 d內(nèi)對(duì)300 mg/L二甲戊靈的降解率為50.3%,明顯高于其他菌株,故選擇菌株XSP6做進(jìn)一步研究。Ni等通過(guò)富集培養(yǎng)的方法分離了13株微生物,結(jié)果顯示只有三株能夠降解二甲戊靈,P13菌株能夠降解99.8%的二甲戊靈[25]。

圖1 不同菌株對(duì)二甲戊靈的降解Fig.1 Degradation of pendimethalin with different strains

2.3 菌株的鑒定結(jié)果

2.3.1 菌株的形態(tài)及生理生化特征 XSP6菌株的酵母菌形態(tài)明顯,菌落乳白色,菌體圓滑有光澤、伴有凸起且邊界整齊。通過(guò)顯微鏡對(duì)菌株形態(tài)進(jìn)行觀察,發(fā)現(xiàn)XSP6為卵圓形,見(jiàn)圖2。表1詳細(xì)列出了XSP6菌株的形態(tài)及生理生化特征信息。結(jié)合形態(tài)學(xué)分析,最終確定XSP6菌株為酵母菌。

表1 形態(tài)及生理生化特征Table 1 Morphology and physiological and biochemical characteristics

圖2 XSP6的形態(tài)特征Fig.2 Morphology of XSP6

2.3.2 26S rRNA基因序列分析 測(cè)得酵母菌XSP6的26S rRNA基因序列長(zhǎng)度為496 bp。將得到的基因序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì),獲得各序列的同源性信息,并利用Mega 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),結(jié)果見(jiàn)圖3。序列比對(duì)結(jié)果表明,菌株XSP6與Candidatropicalis的26S rRNA序列相似度最高,綜合菌株的形態(tài)特征、常規(guī)生理生化特征和26S rRNA序列測(cè)定/同源性比較結(jié)果,初步鑒定酵母菌XSP6是熱帶假絲酵母。熱帶假絲酵母是一種較常見(jiàn)的假絲酵母,又稱熱帶念珠菌。

圖3 酵母菌XSP6的26S rRNA D1/D2基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of XSP6 basedon 26S rRNA D1/D2 gene sequence

2.4 二甲戊靈的初始濃度對(duì)酵母菌降解率的影響

二甲戊靈的初始濃度對(duì)酵母菌XSP6降解率的影響如圖4所示,酵母菌XSP6在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)對(duì)二甲戊靈降解率是隨其濃度增加而逐漸增加。胡佳月等認(rèn)為,隨著培養(yǎng)液中二甲戊靈質(zhì)量濃度的升高,降解率逐漸降低。當(dāng)二甲戊靈質(zhì)量濃度升至1000 mg/L時(shí),菌株JY-2 和JY-5的降解率僅為25.87%和30.44%[27]。林愛(ài)軍等認(rèn)為,二甲戊靈低質(zhì)量濃度時(shí),菌株體內(nèi)的降解活性較高,有利于其降解;而達(dá)到一定質(zhì)量濃度后,菌株生長(zhǎng)受到抑制,降解率下降[28]。

圖4 二甲戊樂(lè)靈濃度對(duì)降解率的影響Fig.4 Effect of the concentration of pendimethalin on biodegradation rate

2.5 接種量對(duì)降解率的的影響

接菌量對(duì)農(nóng)藥降解率的影響如圖5所示。從圖5可以看出,當(dāng)接種量在1%～2.5%區(qū)間時(shí),二甲戊靈的降解率隨著接種量的增加而增加,但是當(dāng)接種量從2.5%升到5%后,降解率表現(xiàn)出略微下降的趨勢(shì)。推測(cè)這種現(xiàn)象的原因是:提高接種量可以促使菌體大量繁殖,降解能力快速增強(qiáng);當(dāng)接種量過(guò)多,培養(yǎng)體系中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)匱乏,造成菌體之間在空間、營(yíng)養(yǎng)上的競(jìng)爭(zhēng),導(dǎo)致菌體出現(xiàn)“早衰”,降解率降低;同時(shí),菌體降解產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物可能會(huì)降低微生物與二甲戊靈的接觸,也導(dǎo)致降解率降低。由此可知,2.5%的接種量時(shí)二甲戊靈的降解率最高。與陳婷等的研究結(jié)果相似,隨著接種量的增大,菌株B90A對(duì)六氯環(huán)己烷(hexachlotocyclohexane,HCH)的降解率也相應(yīng)提高,適宜接菌量為5%[29]。

圖5 接種量對(duì)生物降解率的影響Fig.5 Effect of the inoculation quantity on biodegradation rate

2.6 蔗糖濃度對(duì)二甲戊靈降解率的影響

不同碳源濃度對(duì)農(nóng)藥降解率大小的影響詳見(jiàn)圖6。由圖6可知,蔗糖濃度由0.5%增加至1.5%時(shí),二甲戊靈的降解率增長(zhǎng)迅速,當(dāng)蔗糖濃度由1.5%增加至2.0%,二甲戊靈的降解率呈緩慢下降趨勢(shì)。酵母菌XSP6在蔗糖濃度2.0%時(shí)降解率最大為66.2%,表明菌株在降解二甲戊靈時(shí)有最適合的蔗糖濃度,才能發(fā)揮最佳降解效率。推測(cè)出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因?yàn)?無(wú)外加碳源時(shí),細(xì)菌生長(zhǎng)收到抑制,降解率較高[30];加入少量外加碳源能夠促進(jìn)細(xì)菌的迅速增長(zhǎng)[31]。

圖6 蔗糖濃度對(duì)生物降解率的影響Fig.6 Effect of the concentration of sucrose on biodegradation rate

蔗糖是比農(nóng)藥更易被微生物利用的碳源,因此菌體對(duì)農(nóng)藥的降解率變化不顯著。由此可知,降解酶的產(chǎn)量受到生存環(huán)境中底物的影響,它只有在合適的條件下,才可以有效降解農(nóng)藥。朱魯生等發(fā)現(xiàn),微生物降解農(nóng)藥需要合適的外加碳源質(zhì)量分?jǐn)?shù)來(lái)保證細(xì)胞的正常代謝[26]。

3 結(jié)論

從棉花連作并常年施加除草劑二甲戊靈的土壤中,經(jīng)富集篩選獲得YL128、YL127、YL125、YLW和XSP6降解農(nóng)藥的菌株,其中XSP6的降解效果最好。對(duì)XSP6進(jìn)行生理生化測(cè)定和26S rRNA D1/D2區(qū)序列分析,初步鑒定其為熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)。當(dāng)接種量2.5%、外加碳源2%時(shí),熱帶假絲酵母菌XSP6 5 d內(nèi)對(duì)300 mg/L二甲戊靈降解率最高為66.2%。關(guān)于微生物降解酶的研究有待進(jìn)一步完成。本研究篩選的酵母菌XSP6對(duì)農(nóng)藥污染的水體和土壤生物修復(fù)提供了理論依據(jù)。隨著研究的深入,酵母菌在環(huán)境污染治理中的應(yīng)用將會(huì)越來(lái)越廣闊。