大連刺參多糖的提取純化及體外抗氧化活性研究

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(1.大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧大連 116023;2.遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院,遼寧大連 116023)

我國海域分布有140多種海參,其中可被食用的有約40種[1],刺參屬溫帶種,在我國主要分布于黃渤海區(qū)域。刺參富含多種生物活性物質(zhì),如刺參多糖、膠原蛋白、皂苷等[2],刺參多糖主要存在于體壁中,主要分為兩類:一類為海參糖胺聚糖,即海參硫酸軟骨素,另一類為海參巖藻聚糖硫酸酯[3]。研究表明,刺參多糖具有提高免疫力、抗腫瘤、抗疲勞、降三高等多種生理活性[4],但其在加工過程中很容易流失[5]。

目前海參多糖的提取方法主要有酶解醇沉法、堿提法、熱提法等,提取分離得到的多糖蛋白含量較高。去除多糖中蛋白的方法有Sevage法[6]、三氯乙酸法(TCA)[7]及三氟三氯乙烷法等[8]。Sevage法雖然條件溫和,但效率不高,需反復(fù)多次;TCA法脫蛋白效果較好,但其酸性環(huán)境易導(dǎo)致多糖水解,且易于殘留;三氟三氯乙烷易揮發(fā),較少使用。D-(+)-葡萄糖酸δ-內(nèi)酯(GDL)是一種用來制作豆腐的蛋白凝固劑,水解后可使蛋白質(zhì)凝結(jié)[9-10],達(dá)到脫蛋白的效果。目前有關(guān)GDL脫除多糖蛋白的報道較少。

本文以大連刺參為原料,通過酶解水提醇沉法提取多糖,采用響應(yīng)面法對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,再用GDL對刺參粗多糖進(jìn)行脫蛋白處理,通過正交試驗,對脫蛋白條件進(jìn)行優(yōu)化,采用化學(xué)法評價其體外抗氧化活性,以期為刺參多糖的提取純化工藝及生理活性的研究提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

底播鮮活刺參 大連市長海縣;95%無水乙醇、濃硫酸、酒石酸鉀鈉、苯酚、3,5-二硝基水楊酸 天津科密歐化學(xué)試劑有限公司;木瓜蛋白酶、考馬斯亮藍(lán)G-250、D-葡萄糖、牛血清蛋白、GDL、溴化鉀 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;所用試劑 均為分析純。

WD-2102A全自動酶標(biāo)儀 北京六一生物科技有限公司;JA1003電子分析天平、LC-10N-50C冷凍干燥機(jī) 上海力辰儀器有限公司;V-1300可見分光光度計 上海美析儀器有限公司;MS-TS分析天平 梅特勒-托利多國際有限公司;傅里葉轉(zhuǎn)換紅外光譜儀 FTIR-7600西安禾普生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 刺參粗多糖提取工藝流程 鮮活刺參→去內(nèi)臟、洗凈、勻漿→冷凍干燥→粉碎過80目篩→刺參凍干粉→酶解→醇沉→凍干。

稱取適量刺參凍干粉,加入去離子水混合搖勻(固定料液比1∶30 g/mL),加入一定量的木瓜蛋白酶,在一酶解溫度一定pH條件下提取3 h,98 ℃滅酶20 min,冷卻至室溫,9000 r/min離心15 min取上清液,加入3倍體積75%的乙醇,靜置過夜,9000 r/min離心15 min取沉淀,冷凍干燥后得刺參粗多糖。

1.2.2 刺參粗多糖提取單因素實驗 以刺參凍干粉為原料酶解提取刺參多糖,以刺參多糖提取率為指標(biāo),按1.2.1的方法分別進(jìn)行單因素實驗。固定料液比1∶30 (g/mL)、55 ℃、pH7.0條件下,考察加酶量0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%對多糖提取率的影響;固定料液比1∶30 (g/mL)、加酶量1.5%、55 ℃,考察pH6.0、6.5、7.0、7.5、8.0對多糖提取率的影響;固定料液比1∶30 (g/mL)、加酶量1.5%、pH7.0,考察酶解溫度45、50、55、60、65 ℃對多糖提取率的影響。

1.2.3 刺參粗多糖提取工藝的響應(yīng)面法優(yōu)化 依據(jù)單因素實驗結(jié)果,以多糖提取率為響應(yīng)值,加酶量、pH、酶解溫度為自變量,根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計,進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗,得出最佳酶解條件。實驗因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面因素與水平設(shè)計Table 1 Factors and level designs of the response surface experiment

1.2.4 刺參多糖GDL脫蛋白工藝 將上述步驟獲得的刺參粗多糖配成50 mg/mL的多糖溶液,加入一定量20%的D-葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯(GDL)溶液,在一定溫度下恒溫水浴反應(yīng)一定時間,8000 r/min離心10 min取上清,加入3倍體積75%的乙醇,靜置過夜,醇沉后得脫蛋白的多糖沉淀,冷凍干燥得脫蛋白的刺參多糖。

1.2.5 刺參多糖GDL脫蛋白單因素實驗設(shè)計 以刺參多糖為原料,刺參多糖蛋白脫除率為指標(biāo),按1.2.4的方法,固定時間2.0 h、GDL加入量1.5%條件下,考察溫度30、40、50、60、70 ℃對刺參多糖蛋白脫除率影響;固定溫度50 ℃、GDL加入量1.5%條件下,考察時間1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h對刺參多糖蛋白脫除率影響;固定溫度50 ℃、時間2.0 h條件下,考察GDL加入量0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%對刺參多糖蛋白脫除率影響。

1.2.6 刺參多糖GDL脫蛋白正交試驗設(shè)計 在單因素實驗的基礎(chǔ)上,以刺參多糖蛋白脫除率為指標(biāo),溫度、時間、GDL加入量為因素,進(jìn)行L9(34)正交試驗,優(yōu)化獲得最優(yōu)條件。正交實驗設(shè)計如表2。

表2 正交試驗水平及因素Table 2 Factors and levels of orthogonal array

1.2.7 刺參多糖含量的測定及提取率計算 采用苯酚硫酸法[11]測定總糖含量,采用3,5-二硝基水楊酸法[11]測定還原糖含量,刺參多糖含量(%)=總糖含量(%)-還原糖含量(%)。刺參多糖提取率(R)的計算公式為:

其中,M1為刺參多糖凍干粉質(zhì)量(g);C1為刺參多糖凍干粉多糖含量(%);M2為刺參凍干粉質(zhì)量(g);C2為刺參凍干粉多糖含量(%)。

1.2.8 蛋白質(zhì)含量的測定 采用考馬斯亮藍(lán)法測蛋白質(zhì)含量[12]。蛋白脫除率(R)的計算公式為:

其中:C′1為刺參多糖溶液中蛋白質(zhì)含量(mg/mL),V1和V2分別為脫蛋白前后溶液體積(mL),C′2為脫除蛋白后刺參多糖溶液中蛋白質(zhì)含量(mg/mL)。

1.2.9 刺參多糖結(jié)構(gòu)分析 采用紅外光譜法[2],取干燥后的刺參多糖1 mg,與干燥后的溴化鉀粉末混合壓成透明薄片,在傅里葉轉(zhuǎn)換紅外光譜儀上掃描紅外光譜吸收值(500～4000 cm-1),分析得到刺參多糖結(jié)構(gòu)。

1.2.10 刺參多糖的體外抗氧化性測定

1.2.10.1 DPPH自由基清除能力測定參考文獻(xiàn)[13]的方法 分別向1 mL 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL的多糖溶液中加入1 mL 0.1 mmoL/L DPPH乙醇溶液搖勻,避光反應(yīng)30 min,于517 nm處測定吸光度值A(chǔ)1;以無水乙醇代替DPPH乙醇溶液于517 nm測定吸光度值A(chǔ)2,以無水乙醇代替多糖溶液測定吸光度值A(chǔ)0,以VC取代多糖溶液做陽性對照。DPPH自由基清除率計算公式為:

1.2.10.2 羥自由基清除能力測定 采用水楊酸法測定[14-15],分別向1 mL 1、2、3、4、5、6 mg/mL的多糖溶液中加入1.0 mL的9 mmol/L的FeSO4溶液,9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液和8.8 mmol/L H2O2溶液,37 ℃水浴中避光反應(yīng)30 min后于510 nm處測定吸光度B1,用蒸餾水代替H2O2溶液測吸光度值B2,用蒸餾水能代替多糖溶液測吸光度值B0。其清除率計算公式為:

1.2.10.3 超氧陰離子自由基清除能力測定 采用鄰苯三酚自氧化測定[16-17],向1 mL 1、2、3、4、5、6 mg/mL的刺參多糖溶液中加入2 mL蒸餾水和3 mL Tris-HCl(pH=8.2)緩沖溶液,在25 ℃恒溫水浴中10 min,加入50 μL鄰苯三酚-HCl溶液,震蕩后在325 nm測吸光度值,每10秒記錄一次,以波長為橫坐標(biāo),時間為縱坐標(biāo)計算斜率K1;用蒸餾水代替樣品溶液同樣方法計算斜率K0,計算公式如下:

1.2.10.4 ABTS+自由基清除能力測定 參照文獻(xiàn)[18-19]的方法,分別向0.2 mL 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL的多糖溶液及VC對照液中加入0.8 mL ABTS工作液,搖勻后靜置6 min,在734 nm下測定吸光度值C1,用無水乙醇代替樣品溶液同樣方法測定吸光度值C0,計算公式如下。

1.3 數(shù)據(jù)處理

單因素實驗采用origin 8.6 和Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。Box-Behnken設(shè)計采用Design Expert 8.0.6 軟件對響應(yīng)面實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項回歸擬合方差分析、顯著性檢測和響應(yīng)面分析,P<0.05 具有顯著性差異,P>0.05差異不顯著。正交試驗采用SPSS 19.0進(jìn)行設(shè)計分析。各組試驗均重復(fù)3次,數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 刺參多糖單因素實驗結(jié)果

2.1.1 加酶量對多糖提取率的影響 由圖1可知,隨著木瓜蛋白酶用量增多,刺參粗多糖提取率呈現(xiàn)明顯上升的趨勢,在加酶量為1.5%時達(dá)到最高值,之后多糖提取率呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢。這可能由于酶濃度已達(dá)到飽和狀態(tài),之后酶解效率降低導(dǎo)致提取率下降[20]。因此,選擇最佳加酶量為1.5%。

圖1 加酶量對多糖提取率的影響Fig.1 Effect of enzyme content on polysaccharide yield

2.1.2 pH對多糖提取率的影響 不同pH對多糖提取率的影響如圖2所示,在pH在6.5～7.0之間,隨著pH的增加,刺參多糖提取率明顯提高,在pH為7.0時達(dá)到最大值;當(dāng)pH大于7.0后,多糖提取率趨于平緩后再明顯下降。這是因為pH的高低直接影響蛋白酶的活性,當(dāng)超過最適pH，酶活性受到抑制,因此,選擇pH7.0為最佳條件。

圖2 pH對多糖提取率的影響Fig.2 Effect of pH on polysaccharide yield

2.1.3 酶解溫度對多糖提取率的影響 由圖3可知,在55 ℃之前,多糖提取率隨溫度的上升而增大,當(dāng)溫度在55 ℃時達(dá)到最大值5.28%,之后隨著溫度的上升呈現(xiàn)明顯下降的趨勢。與王婷等[21]的研究結(jié)果基本一致。這是因為酶的催化反應(yīng)速度隨著溫度的升高而加快,但當(dāng)達(dá)到酶的最適反應(yīng)溫度后,酶的穩(wěn)定性會遭到破壞,導(dǎo)致酶解效率降低[22]。因此,選擇最佳溫度為55 ℃。

圖3 酶解溫度對多糖提取率的影響Fig.3 Effect of enzymolysis temperature on polysaccharide yield

2.2 刺參粗多糖提取響應(yīng)面試驗結(jié)果

表3 響應(yīng)面實驗設(shè)計與結(jié)果Table 3 Experimental design and results of response surface methodology

模型方差分析如表4所示,模型的P<0.0001,說明此回歸模型極顯著,并且失擬項不顯著(P>0.05),R2=0.9935,說明模型具有較好的擬合性[23]。一次項X2和交互項X1X2、X2X3及3個二次項達(dá)到極顯著水平(P<0.01),一次項X1和X3達(dá)到顯著水平(P<0.05),交互項X1X3不顯著。P值越小,F值越大,則相應(yīng)變量的顯著程度越高,由表4可知,3個因素對多糖提取率的影響大小為:pH>加酶量>酶解溫度。

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis for the established native regression model

2.2.2 響應(yīng)面分析與驗證 響應(yīng)面模型中3D曲面圖的陡峭程度和等高線圖的形狀可以直接反映出自變量對因變量的影響情況及因變量間交互作用的顯著程度[24]。當(dāng)兩因素間交互作用顯著時,響應(yīng)面越陡,等高線呈橢圓形;反之,響應(yīng)面越緩,等高線呈圓形[25]。由圖4可以看出,加酶量、酶解溫度和pH彼此之間的交互作用對多糖提取率的影響顯著(P<0.05),與方差分析結(jié)果一致。響應(yīng)面優(yōu)化得到的刺參多糖提取最佳條件為:加酶量1.59%、pH7.31、酶解溫度53.80 ℃,預(yù)測值的刺參多糖提取率為5.36%。為了便于實際操作,將工藝參數(shù)調(diào)整為加酶量1.60%、pH7.30、酶解溫度54.0 ℃,在此工藝條件下刺參多糖提取率為5.34%±0.04,與預(yù)測值相比,相對誤差僅為0.02。

圖4 各因素交互作用響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface map of interaction of various factors

2.3 刺參粗多糖GDL脫蛋白提取工藝優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 刺參粗多糖GDL蛋白脫除單因素實驗結(jié)果 溫度、反應(yīng)時間和GDL加入量對蛋白脫除率的影響如圖5～圖7所示。隨著GDL加入量的增加,蛋白脫除率呈現(xiàn)上升的趨勢,當(dāng)GDL加入量達(dá)到2.0 mL時,蛋白脫除率趨于穩(wěn)定;隨著溫度的升高,蛋白脫除率呈現(xiàn)增加的趨勢,在50 ℃達(dá)到最高,之后呈現(xiàn)下降的趨勢;在1.0～2.0 h蛋白脫除率隨著時間的延長呈現(xiàn)上升的趨勢,但上升幅度較小,僅為1.67%,2.0 h之后呈現(xiàn)下降的趨勢,但幅度也很小僅為1.74%。

圖5 GDL加入量對粗多糖蛋白脫除率的影響Fig.5 Effect of GDL addition on crude polysaccharide deproteinization yield

圖6 溫度對粗多糖蛋白脫除率的影響Fig.6 Effect of temperature on crude polysaccharide deproteinization yield

圖7 反應(yīng)時間對粗多糖蛋白脫除率的影響Fig.7 Effect of time on crude polysaccharide deproteinization yield

2.3.2 刺參粗多糖GDL蛋白脫除正交試驗結(jié)果 從表5～表6可以看出,GDL的加入量對刺參多糖蛋白脫除率影響顯著,其他兩個因素?zé)o顯著影響。各因素對刺參多糖蛋白脫除率影響程度大小為C>A>B,即GDL加入量>溫度>時間,其最優(yōu)組合為A3B2C3,即反應(yīng)溫度60 ℃、反應(yīng)時間2 h、GDL溶液加入量2.5 mL。驗證試驗得GDL蛋白脫除率為95.8%。

表5 蛋白脫除率正交試驗結(jié)果Table 5 Orthogonal array design with experimental results of deproteinization yield

表6 GDL脫蛋白正交試驗結(jié)果方差分析Table 6 Analysis of variance of the experimental results of orthogonal array design for GDL deproteinization

2.4 刺參多糖的紅外光譜分析

刺參多糖的紅外光譜圖見圖8。刺參多糖在3351 cm-1出現(xiàn)O-H和N-H伸縮振動峰,O-H為多糖的特征峰,N-H為糖胺聚糖的特征峰;在2949和2874 cm-1分別出現(xiàn)C-H伸縮振動(-CH2-)峰,由巖藻糖甲基引起[26];在1662 cm-1出現(xiàn)了C=O伸縮振動(-CHO)和(-CONH2)峰,為乙酰氨基的特有吸收峰[21];在1560 cm-1出現(xiàn)C=O非對稱伸縮振動(-COOH)峰,為糖醛酸吸收峰;在1337和1411 cm-1出現(xiàn)O-H變角振動(-COOH)峰;在1256 cm-1出現(xiàn)S=O伸縮振動峰,說明刺參多糖富含硫酸基取代;在1026 cm-1出現(xiàn)C-O伸縮振動(C-O-H和C-O-C)峰;在851 cm-1出現(xiàn)C-O-S伸縮振動(軸向配位)峰,說明均存在α-端基差向異構(gòu)C-H變角振動的糖環(huán),含有α-D-葡萄吡喃糖環(huán)。當(dāng)巖藻聚糖硫酸酯中C-2和C-4位存在雙硫酸基取代時,會在837 cm-1處出現(xiàn)較強(qiáng)吸收峰[27],而刺參多糖在850 cm-1附近有吸收峰,說明C-4位可能在氨基半乳糖和巖藻糖的硫酸基取代。從C-O-S伸縮振動的波數(shù),可以確定氨基半乳糖和巖藻糖上的硫酸基取代是軸向取代為橫向取代[28],在1200～950 cm-1的波長范圍內(nèi)被稱為分子的指紋識別,通過它可以鑒定多糖里的主要化學(xué)基團(tuán),吸收峰的位置和強(qiáng)弱是每個多糖所特有的[29]。

圖8 刺參多糖紅外光譜圖Fig.8 FT-IR spectrum of sea cucumber polysaccharide

2.5 刺參多糖抗氧化活性分析

2.5.1 刺參多糖對DPPH的清除能力分析 DPPH自由基是一種穩(wěn)定的有機(jī)自由基,已被廣泛用于自由基清除能力的分析中[30]。刺參多糖和VC對DPPH自由基的清除能力結(jié)果如圖9所示,刺參多糖對DPPH自由基的清除能力隨著濃度的升高呈上升趨勢,在濃度達(dá)到1.5 mg/mL時清除率達(dá)到72.6%并趨于穩(wěn)定。而相同條件下,陽性對照組VC的清除率達(dá)到96.6%,由此可知,VC對DPPH自由基的清除能力更強(qiáng),但刺身多糖也有一定清除DPPH自由基能力。通過計算分析得到刺參多糖的IC50為0.3 mg/mL。

圖9 DPPH自由基清除率Fig.9 Scavenging effects of DPPH free radical

2.5.2 刺參多糖對羥自由基的清除能力分析 羥自由基是目前已知活性氧中毒性最強(qiáng)的一種自由基,與衰老、腫瘤及細(xì)胞吞噬等有關(guān),可導(dǎo)致機(jī)體的氧化性損傷,羥自由基清除率已成為活性物質(zhì)抗氧化作用的重要指標(biāo)[31-32]。刺參多糖和VC對羥自由基的清除能力結(jié)果如圖10所示,刺參多糖對羥自由基的清除能力呈逐漸增強(qiáng)的趨勢,在濃度達(dá)到4 mg/mL時清除率達(dá)到57.4%并趨于穩(wěn)定,但低于相同濃度下VC的清除率99.2%。通過計算分析得刺參多糖清除羥自由基的IC50為4.5 mg/mL。

圖10 羥自由基清除率Fig.10 Scavenging effects of hydroxyl free radicals

2.5.3 刺參多糖對超氧陰離子的清除能力分析 由圖11可知,刺參多糖對超氧陰離子的清除能力隨著多糖濃度的增大呈現(xiàn)上升的趨勢,具有明顯的量效關(guān)系,在濃度達(dá)到6.0 mg/mL時清除率達(dá)到71.7%。相同濃度下VC的清除率達(dá)到99.4%,刺參多糖的清除能力雖然不如VC,但清除率超過了50%,可以作為一種有效的超氧陰離子清除劑使用。通過計算分析得刺參多糖的超氧陰離子的清除能力IC50為3.9 mg/mL。

圖11 超氧陰離子清除率Fig.11 Scavenging effects of superoxide anion

2.5.4 刺參多糖的ABTS+自由基清除能力分析 ABTS+自由基清除法已廣泛應(yīng)用于生物活性物質(zhì)的抗氧化能力的評價中,是基于氧化劑可使ABTS+自由基溶液顏色發(fā)生變化,吸光度值降低[33]。從圖12可知,在刺參多糖濃度小于1.5 mg/mL時,其ABTS+自由基清除能力呈現(xiàn)明顯上升的趨勢,之后趨于穩(wěn)定,其清除率略小于VC的清除率95.7%,刺參多糖清除率達(dá)到90.4%。通過計算分析得刺參多糖清除ABTS+自由基的IC50為0.85 mg/mL。

圖12 ABTS自由基清除率Fig.12 Scavenging effects of ABTS free radical

3 結(jié)論

木瓜蛋白酶酶解提取刺參多糖的最優(yōu)酶解提取條件為:加酶量1.60%、pH7.30、溫度54.0 ℃,在此條件下刺參多糖提取率為5.34%。GDL法脫除刺參多糖蛋白的最優(yōu)條件為反應(yīng)溫度60 ℃、時間2 h、20% GDL溶液加入量2.5 mL,在此條件下蛋白脫除率為95.8%。刺參多糖對DPPH、羥自由基、超氧陰離子及ABTS自由基都有很好的清除作用,并呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系,其中,刺參多糖濃度3.0 mg/mL時ABTS+自由基的清除能力最強(qiáng),且與陽性對照VC的清除能力相差不明顯,表明刺參多糖具有較強(qiáng)的抗氧化能力。這一提取方法可為刺參多糖的制備和產(chǎn)品開發(fā)提供理論依據(jù)。