探討實時熒光定量PCR儀用于流感病毒檢測的效果分析

羅周正 張麗艷 李 賀 杜 波

（阜新市衛生健康服務中心（阜新市疾病預防控制中心）檢驗檢測部，遼寧 阜新 123000）

流感在臨床上屬于流感病毒引發的一種急性呼吸道傳染病，因流感病毒屬于RNA病毒，且潛伏期短，傳染性較強及已發生變異等特點，一旦感染流感病毒，嚴重降低了患者的生活質量，甚至威脅生命健康。臨床通常采取分離病毒、鑒定病毒或細胞培養作為檢測流感病毒的常用手段，但因消耗時間長，特別是針對爆發疫情時難以滿足病毒診斷的要求。據有關臨床實驗室最新研究表示，實時熒光定量PCR技術被廣泛應用在臨床實踐中，除有操作簡便、靈敏度及自動化程度高外，還對核酸具備較高的擴增性及檢測快等優勢，深得廣大患者一致好評與認可[1]。因此，為對實時熒光定量PCR技術在流感病毒檢測中的診斷價值進一步探討，本研究對我市哨點醫院采集疑似流感病毒樣本檢測后予以臨床分型，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料：回顧分析于2018年10月至2019年3月期間前來我市哨點醫院就診疑似流感病毒患者共530例納入本次實驗，并對以上對象流感病毒樣本進行采集。530例流感病毒樣本中包含男性患者330例、女性患者200例；科室包含兒科門診患者110例、內科門診患者190例、呼吸科病房患者230例。以上所有標本采集、存儲、運輸等各項操作均依據《甲型H1N1流感病毒實驗室檢測技術方案》有關文件進行執行。將采集的所有標本及時送往流感監測網絡實驗室，并由檢驗人員在規定時間內完成檢測。針對未能在24h完成的檢驗，應置于-70 ℃的環境下冷凍保存。

1.2 檢驗儀器與檢驗方法

1.2.1 儀器型號與試劑：ABI 7500 Fast熒光PCR擴增儀（美國Thermo公司生產）；核酸提取采用RNA病毒提取試劑盒RNeasy Mini Kit（QIAGEN公司，貨號74104）；PCR反應試劑（碩世生物科技有限公司）；狗腎傳代細胞（由遼寧省疾病預防控制中心感染與傳染性疾病防制所提供）[2-3]。

1.2.2 標本采集和處理：采用核酸提取盒實時熒光定量PCR法提取樣本季節性H1亞型、季節性H3亞型、新甲H1亞型、H5、H7、H9等亞型檢測，且所有操作過程均依據試劑盒使用說明說進行操作[2]。按照說明，將RNA經過反轉錄處理后擴增，擴增條件為，50 ℃ 30 min，1個循環，95 ℃ 5 min，1個循環，95 ℃ 10 s，45個循環，55 ℃ 40 s，45個循環，最后采取FAM信道在55 ℃下單點熒光檢測[3-4]。

1.2.3 病毒細胞分離鑒定：采集樣本中適當加入10000 U/mL雙抗接種于單層狗腎傳代細胞，并注意觀察細胞病變，對病毒培養液進行細胞凝血試驗，結合細胞病變及細胞凝集進行檢測。若凝集試驗符合1∶16以上的細胞培養，可采用有關亞型標準血清給予紅細胞凝集抑制試驗來作為流感病毒型別和亞型的鑒定[5-6]。

1.3 觀察指標：統計兩組檢測方式對陽性流感病毒及臨床分型（新甲H1型、H3亞型、B型）陽性檢出率情況。

1.4 統計學方法：采用SPSS22.0統計學軟件，卡方檢驗以P＜0.05作為差異有統計學意義；則兩個連續變量間呈線性相關時，使用Pearson積差相關系數進行分析。

2 結果

2.1 比較兩組檢測方法對流感病毒樣本不同分型檢測結果情況，見表1。

2.2 比較兩組檢測方法對陽性流感病毒不同分型檢出率情況，見表2。

表1 兩組檢驗方法流感病毒檢測結果對比

表2 兩組檢測方法對陽性流感病毒不同分型檢出率對比（n，%）

3 討論

流感病毒最常用的檢測方法較多，包含PCR、血清學診斷以及細胞培養法，即可保證流感病毒的抗原性和原始標本保持一致性，加上利于長時間保存，能夠更好的對病毒抗原性及基因進行分析。經最新研究成果表明，因細胞培養法的檢出率受到大量病毒載量及樣本質量影響，一旦樣本質量低或病毒載量不夠時，極易存在一定的假陰性[7-8]。與此同時，細胞培養法處于局限性，為確保病毒活性，只能單純用于活體病毒[9]。

實時熒光定量PCR技術在臨床上主要適用于流感、禽流感、麻疹、手足口病等傳染性疾病診斷，且在食品安全上、科學研究等方面也發揮了重要作用[10]。本研究通過采用實時熒光定量PCR法，針對流感病毒鑒別多株多亞型流感病毒，具有實時熒光定量PCR技術主要是通過擴增至每一個循環產物熒光信號，進而能夠對達到擴增反應產物進行定量和定性分析，伴隨產物的增多，進一步促使熒光信號強度增強，若經過一個循環后，自然被熒光強度信號收集。較高的特異性及靈敏性[11-12]。經國內有關臨床實踐表示，實時熒光定量PCR具有操作便捷、反應速度快、具備較強的敏感性及直觀性，通過定量檢測深得臨床醫師及患者滿意的效果[13]。

本次研究證實了實驗組檢出89例陽性標本，陽性率為16.79%，其中包括新甲H1型71例、H 3亞型14例、B型4例；則參照組檢出57例陽性標本，陽性率為10.75%，包括新甲H1型52例、H 3亞型3例、B型2例，實驗組高于參照組，P＜0.05。由此說明，通過選自2018年10月至2019年3月對我市哨點醫院收集的530例疑似流感病毒攜帶者樣本進行檢測后發現，使用實時熒光定量PCR法檢測出的陽性率更高，且兩組均未查出H5、H7、H9型，且在進入11月-次年1月份流感病毒的檢出率相對較高，是引發流感病毒的傳播及擴散的最佳時機，冬季天氣寒冷，人體抵抗力減弱，容易受寒。加上，人們多半時間在室內活動，窗戶常管閉，導致空氣不流通，病毒更容易傳播。

綜上所述：較細胞培養法而言，選擇實時熒光定量PCR法應用在流感病毒診斷中的臨床價值更高，值得進一步推廣與借鑒。