顯微鏡輔助下結腸區段切除術在裸鼠結腸癌模型中的應用研究

杜繼明 王貴鑫 趙雪峰 宮愛民

（大連大學附屬新華醫院肛腸外科，遼寧 大連 116021）

在動物實驗領域，傳統的原發性結腸癌及其轉移性結腸癌模型的制作遠遠滿足不了飛速發展的腫瘤手術縮小化理念需求，因此建立精準顯微鏡輔助下手術模型的制作迫在眉睫。近年來臨床研究結果中，發現早期結直腸癌選擇了以腫瘤為中心的局部切除手術和（或）附加前哨淋巴結清掃，與結腸癌根治性手術相比，其5年生存率無顯著差異[1-2]。本研究首選建立穩定的結腸癌模型后，此基礎上再建立結腸癌切除手術模型，并與開關手術模型相比較術中、術后情況及生存率情況。由于理論上可行的結腸癌根治手術模型的制作障礙，加上人力、物力及技術上的制約，只好選用了結腸區段切除手術模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和材料：7周齡雄性，體質量18～20 g，BALb/c品系20只實驗裸鼠購于大連醫科大學實驗動物中心。人結腸癌細胞株HT29由大連大學附屬新華醫院醫學研究中心構建并提供。本研究由經大連大學附屬新華醫院醫學研究倫理委員會審批通過。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和細胞混懸液制備：將人結腸癌細胞株HT29在37 ℃、5%CO2，含10%小牛血清的培養基內傳代培養，每2～3 d洗換1次培養液。培養細胞融合達80%～90%，采用胰酶消化后，1200 rpm/min離心3 min，棄上清液，將無小牛血清的培養基加細胞洗滌3次，顯微鏡下細胞計數，用無小牛血清培養基調整細胞濃度至4×107/mL，共備1 mL。將已制備的細胞混懸液在冰浴中保存，備30 min內完成接種。

1.2.2 模型設計：制模前1周為實驗裸鼠安定期，需對實驗裸鼠禁止進行一切刺激性操作。參與模型的實驗裸鼠共20只，首先建立穩定的裸鼠原發性結腸癌模型4周，其后將結腸癌模型裸鼠隨機分成10只顯微鏡輔助下結腸區段切除術組（結腸癌切除手術模型組-研究組）和10只對照組（開關手術模型組）。建立結腸癌模型后實驗裸鼠總觀察周期為8周。

1.2.3 建立顯微鏡輔助下裸鼠結腸癌模型：選用地氟醚進行裸鼠全身麻醉。制模全程采用SMZ-B2/T2體視顯微鏡完成操作。首先，取下腹正中10 mm小切口進入腹腔，利用無損傷鑷子尋找盲腸，并選定距盲腸根部30 mm“升結腸”作為制模部位。其次，采用31號注射器傾斜30°角進針約0.5 mm，將人結腸癌細胞株HT29混懸液50μL（細胞數為2×106）經“升結腸”黏膜層和肌肉層之間緩慢注入。待確認注射部位腸壁顏色變白、腫脹及無滲漏，采用止血紗布外加濕紗布覆蓋注射部位1 min。最后，掀開濕紗布見脾臟無滲漏后逐層關腹。

1.2.4 建立顯微鏡輔助下裸鼠結腸區段切除術模型（結腸癌切除手術模型）：麻醉及開腹顯露同上述。首先，采用鈦夾或絲線結扎標記待切除的兩側腸管，切除范圍為距腫瘤兩側緣1 cm。其次，選用裸鼠專用腸鉗或血管鉗鉗夾兩側待吻合的腸管，切除腫瘤為中心的腸管后，采用10-0血管縫合線連續縫合。最后，見縫合處血運良好，并縫合牢固后止血紗布環周附于吻合口周圍，且進行逐層關腹。

1.2.5 建立顯微鏡下裸鼠結腸癌開關手術模型：麻醉及開腹顯露同上述。不進行對結直腸癌模型的任何創傷性操作。

1.2.6 解剖裸鼠和觀察指標：每天常觀察、記錄實驗裸鼠的一般狀態，實驗裸鼠觀察期滿予以處死。處死后立即解剖觀察，并具體記錄腹腔內血性腹水、腸梗阻、淋巴結腫大/轉移及腹膜種植情況。完整移除病變標本后，利用4%多聚甲醛充分固定。所有病變標本以最大直徑為中心切開并制作組織蠟塊，并以4 μm厚度切片后進行H&E染色，顯微鏡下明確病變標本的性質。

1.3 統計學方法：采用SPSS 20.0統計軟件包進行數據處理。研究組和對照組的計量比較采用χ2-test進行統計分析，研究組和對照組的生存分析采用Kaplan-Meler進行統計分析，P＜0.05為有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組制模情況比較：結腸癌模型成瘤率100%（20/20）。結腸癌切除手術模型組和開腹手術模型組在術中無1例死亡。結腸癌模型成瘤率100%（20/20）。結腸癌切除手術模型組術中無1例死亡。結腸癌切除手術模型組血性腹水、腸梗阻、淋巴結轉移及腹膜種植轉移明顯少于開關手術模型組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 兩組制模情況比較[n（%）]

2.2 兩組生存情況比較：研究組組頻臨死亡處死1例，而觀察期滿8周處死9例；而對照組頻臨死亡處死7例，而觀察期滿8周處死3例。兩組生存曲線分析，結腸癌切除手術模型組生存率明顯優于開關手術模型組，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 兩組生存曲線

3 討 論

對于建立穩定的裸鼠結腸癌模型是研究人結腸癌精準治療的首要緩解。裸鼠結腸癌模型制作包括自發性腫瘤模型、誘發性腫瘤模型、移植性結腸癌模型及轉基因動物腫瘤模型，無論選擇任何方法都有它的長處和適應范圍[3]。由于區域淋巴結轉移是結直腸癌患者局部轉移的第一步，因此裸鼠結腸癌淋巴結轉移模型對抗腫瘤藥物的篩查和腫瘤轉移機制研究具有重要意義[4]。近期對裸鼠結腸癌淋巴管生成模型的制作研究也逐漸升溫[5]。為了更進一步深入研究結直腸癌患者的轉移機制和抗轉移治療方法，需求與人更接近或非細胞系的遠處轉移模型的制作[6]。為此，今后的動物模型制作方向應符合模擬人類疾病進展。裸鼠結腸癌模型的評價手段多種多樣，譬如剖腹探查、MRI技術、IVIS技術及小動物專用PET/CT技術[7-9]。除剖腹探查外，其他的動物模型評價手段還仍未得到普及。

結直腸癌患者的治療原則是以手術治療為主的綜合治療，但人結腸癌實驗動物模型建立的研究只停步在單純建立裸鼠結腸癌模型的初步階段[10]。由于實驗用鼠科動物的腸管壁薄、糞便塊似腸管粗大、肉眼或放大鏡難以完成精準的吻合技術而腸切除相關的報道寥寥無幾，更談不上切除腫瘤周圍水腫的腸切除術。顯微鏡輔助下腫瘤區段切除術的優勢和技巧在于：①選擇全身麻醉；②選用術野直觀的體視顯微鏡；③顯微鏡的放大倍數高達4～40倍；④選用裸鼠專用腸鉗或血管鉗鉗夾腸管；⑤選用10-0血管縫合線連續縫合法進行腸-腸吻合。不僅針對早期結腸癌行腫瘤為中心的局部切除加前哨淋巴結清掃，且針對早期直腸癌行TEM手術等技術理念的更新是本研究設計的初衷[1-2,11]。為提高顯微鏡下腸管吻合技術，建議顯微鏡或放大鏡下連續縫合完成剪斷膠皮手套的手指吻合后，灌滿自來水觀察有無滲漏。顯微鏡操作技術的可行性和腫瘤學行為的安全性方面，本研究結果證實：結腸癌模型成瘤率100%，同時結腸癌切除手術模型組和術中無1例死亡；結腸癌切除手術模型組血性腹水、腸梗阻、淋巴結轉移及腹膜種植轉移明顯少于開關手術模型組，而且結腸癌切除手術模型組生存率明顯優于開關手術模型組。

綜上所述，結腸癌切除手術模型為操作技術要求較高的動物實驗模型。結腸癌切除手術模型在技術層面上安全、可行，但在相對局部晚期結腸癌模型中的遠期腫瘤學行為有待于進一步探索。