沉默HMGA2基因表達逆轉(zhuǎn)急性髓細胞白血病耐藥細胞株HL-60/DNR對柔紅霉素耐藥性的研究

于寶丹 鄭潤輝 李海明

（1 廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院檢驗科，廣東 廣州 510000；2 廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院血液科，廣東 廣州 510000）

急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）是一種骨髓性造血芽細胞異常增殖的血液惡性腫瘤[1]。目前，AML的治療方法主要有化學治療（化療）、放射治療、靶向治療、免疫治療、干細胞移植等。臨床上根據(jù)患者的不同情況選擇不同的綜合治療方案，但仍然以化療為主。AML細胞對化療藥物的耐藥成為AML治療過程中的主要障礙。研究AML細胞產(chǎn)生耐藥的分子機制以及如何克服AML細胞的耐藥表型，對提高AML化療效果具有重要的實際意義。

高遷移率族蛋白2（high mobility group AT-hook 2，HMGA2）是高遷移率族蛋白家族成員之一。HMGA2在多種腫瘤細胞中高表達，能夠促進腫瘤細胞的增殖及轉(zhuǎn)移，并參與腫瘤耐藥的發(fā)生[2-4]。研究發(fā)現(xiàn)，干擾HMGA2能增加野生型AML細胞對柔紅霉素（daunorubicin，DNR）的敏感性[5]。但是對于HMGA2能否逆轉(zhuǎn)AML細胞對柔紅霉素的耐藥性仍未闡明。本文將以HL-60柔紅霉素耐藥細胞株HL-60/DNR為研究對象，分析干擾HMGA2能否逆轉(zhuǎn)HL-60/DNR對柔紅霉素的耐藥性，評估HMGA2作為克服白血病細胞耐藥的分子靶點的潛能。

1 材料與方法

1.1 主要實驗儀器與試劑：柔紅霉素產(chǎn)自美國Merck；AML細胞系HL-60產(chǎn)自上海中科院細胞庫；基礎培養(yǎng)基和胎牛血清均產(chǎn)自美國Gibco公司；培養(yǎng)板及培養(yǎng)瓶產(chǎn)自美國Corning；Lipofectamine RNAiMAX產(chǎn)自美國Invitrogen；CCK8試劑盒產(chǎn)自日本Dojindo Molecular Technologies公司；Trizol和SYBR GREEN qPCR Super Mix來自美國Invitrogen公司；引物和siRNA由上海吉瑪制藥技術有限公司合成；β-半乳糖苷酶（β-GAL）活性檢測試劑盒（貨號：BC2580）產(chǎn)自北京索萊寶科技有限公司；HMGA2一抗產(chǎn)自美國Abcam公司；ImProm-IITM Reverse Transcription System產(chǎn)自美國promega；CXF96型熒光定量PCR儀產(chǎn)自美國Bio-Rad；MultiscanMK3型全自動酶標儀產(chǎn)自美國Thermo Fisher Scientific。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：按照上海中科院細胞庫提供的方法培養(yǎng)，即在37 ℃、5% CO2的條件下用添加了20%胎牛血清的Iscove's Modified Dulbecco's Medium基礎培養(yǎng)基中培養(yǎng)HL-60細胞。HL-60柔紅霉素耐藥細胞株HL-60/DNR為本實驗室構建，采用體外低濃度梯度遞增聯(lián)合大劑量間斷沖擊方法誘導HL-60細胞對DNR產(chǎn)生耐藥性。

1.2.2 實驗分組與siRNA轉(zhuǎn)染：設計合成HMGA2的siRNA（si-HMGA2，GGAAAGUGUCUUCAAACAAUU）和陰性對照siRNA（si-NC，UUCUCCGAACGUGUCACGUTT）。將HL-60/DNR細胞分為正常培養(yǎng)組、轉(zhuǎn)染si-NC組和轉(zhuǎn)染si-HMGA2組。按照Lipofectamine RNAiMAX的說明書進行轉(zhuǎn)染。

1.2.3 熒光定量PCR：轉(zhuǎn)染48 h后，收集各組細胞，Trizol法提取總RNA；按照ImProm-IITM Reverse Transcription System的說明進行逆轉(zhuǎn)錄；按照SYBR GREEN qPCR Super Mix的說明配制PCR反應體系，CXF96型熒光定量PCR儀上完成熒光定量PCR反應。采用2-△△CT法[6]計算HMGA2 mRNA的相對表達水平。內(nèi)參基因β-actin和HMGA2的引物序列如下：HMGA2上游引物，ACCTAGGAAATGGCCACAACA；HMGA2下游引物，TATAAGATTGCCCGGGTGGT；β-actin上游引物，AGCGAGCATCCCCCAAAGTT；β-actin下游引物，GGGCACGAAGGCTCATCATT。

1.2.4 Western blot：轉(zhuǎn)染48 h后，收集各組細胞，RIPA裂解液提取細胞總蛋白。蛋白定量后，將定量的蛋白進行SDS-PAGE電泳，并通過半干法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜。漂洗后，5%脫脂奶粉溶液室溫封閉1 h，HMGA2或者GAPDH一抗稀釋液4 ℃孵育過夜。次日，經(jīng)過TBST洗膜后，加入相應二抗稀釋液37 ℃孵育1 h。漂洗后，在暗室中曝光。

1.2.5 CCK8實驗：將細胞接種在96孔板，如2.2.2準備正常培養(yǎng)組、轉(zhuǎn)染si-NC組和轉(zhuǎn)染si-HMGA2組HL-60細胞。轉(zhuǎn)染24 h后，使用0、0.1、1、5、7.5和10 μg/mL的DNR處理各組細胞。分別于DNR處理0和24 h后，加入CC8試劑，按照CCK8試劑盒的說明檢測450 nm處的吸光值（OD450）。按照如下公式計算抑制率：抑制率=1-（ODDNR-ODBlank）/（OD0μg/mL-ODBlank）。使用GraphPad Prism 7軟件計算各組細胞的DNR半抑制濃度（IC50）。

1.2.6 β-半乳糖苷酶活性檢測：如2.2.2準備正常培養(yǎng)組、轉(zhuǎn)染si-NC組和轉(zhuǎn)染si-HMGA2組HL-60細胞。轉(zhuǎn)染48 h后，收集各組細胞，按照β-半乳糖苷酶（β-GAL）活性檢測試劑盒的說明書檢測β-半乳糖苷酶活性。

1.2.7 統(tǒng)計分析：應用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示。多因素方差分析檢驗細胞增殖活性的差異，單因素方差分析三組之間實驗指標的差異。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HMGA2在HL-60/DNR細胞中高表達：如圖1所示，與野生型HL-60相比，HL-60柔紅霉素耐藥細胞株HL-60/DNR中HMGA2 mRNA和蛋白的表達水平明顯提高（P＜0.05）。

2.2 成功沉默HL-60/DNR細胞中HMGA2基因表達：如圖2所示，cell組和si-NC組HL-60/DNR細胞中HMGA2 mRNA和蛋白的表達水平無明顯差異。與si-NC組相比，si-HMGA2組HL-60/DNR細胞中HMGA2 mRNA和蛋白的表達水顯著下降（P＜0.05），說明轉(zhuǎn)染si-HMGA2可成功沉默HL-60/DNR細胞中HMGA2基因表達。

2.3 沉默HMGA2基因表達增強DNR對HL-60/DNR細胞的敏感性：使用不同濃度的DNR處理cell組、si-NC組和si-HMGA2組HL-60/DNR細胞，并采用CCK8方法檢測各組細胞的吸光值，并計算抑制率。如圖3所示，DNR對cell組和si-NC組HL-60/DNR細胞的抑制率無明顯差異。與si-NC組相比，DNR對si-HMGA2組HL-60/DNR細胞的抑制率顯著提高（P＜0.05）。另外，DNR對cell組、si-NC組和si-HMGA2組HL-60/DNR細胞的IC50分別為4.46 μg/mL、4.67 μg/mL和0.98 μg/mL，說明。這些結(jié)果說明沉默HMGA2基因表達能增強DNR對HL-60/DNR細胞的敏感性。

圖1 HL-60和HL-60/DNR細胞中HMGA2 mRNA和蛋白的表達水平。

圖2 cell組、si-NC組和si-HMGA2組HL-60/DNR細胞中HMGA2 mRNA和蛋白的表達水平。

圖3 DNR對cell組、si-NC組和si-HMGA2組HL-60/DNR細胞的抑制率。

2.4 沉默HMGA2基因表達增強HL-60/DNR細胞β-半乳糖苷酶活性：如圖4所示，cell組和si-NC組的β-半乳糖苷酶活性無明顯差異；與si-NC組相比，si-HMGA2組HL-60/DNR細胞的β-半乳糖苷酶活性顯著提高（P＜0.05）。

圖4 cell組、si-NC組和si-HMGA2組HL-60/DNR細胞的β-半乳糖苷酶活性。

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，HMGA2不僅參與促進腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，也參與腫瘤耐藥的發(fā)生。目前認為HMGA2主要通過抑制DNA損傷導致的凋亡和增加腫瘤干細胞的自我更新誘導腫瘤細胞出現(xiàn)耐藥性[7-8]。近年來有研究表明腫瘤細胞衰老障礙直接影響化療效果，也是影響腫瘤多藥耐藥的一個重要因素[9]。細胞衰老是指細胞在外在微環(huán)境變化或內(nèi)在特定基因表達與失活等因素作用下不可逆地脫離細胞周期并不可逆地喪失增殖能力后進入的一種相對穩(wěn)定的狀態(tài)[9]。有研究發(fā)現(xiàn)，在原發(fā)性淋巴瘤的治療中，無論凋亡途徑是否正常，采用誘導細胞衰老的方法均可以提高化療效果[10]。Rebbaa研究小組將表達組織蛋白酶L的干擾載體導入淋巴瘤細胞系（HL-60）中，發(fā)現(xiàn)該干擾載體可誘導腫瘤細胞發(fā)生衰老，逆轉(zhuǎn)對阿霉素的耐藥性[11]。那么，在AML發(fā)生發(fā)展的過程中，HMGA2在AML細胞衰老障礙及逆轉(zhuǎn)化療耐藥中是否發(fā)揮作用吶？本文將著重探討這些問題，拓展HMGA2參與腫瘤耐藥的分子機制，評估HMGA2作為逆轉(zhuǎn)AML細胞多藥耐藥分子靶點的可能性，為提高AML的臨床化療效果提供新的研究方向和理論基礎。

我們研究發(fā)現(xiàn)，與野生型細胞相比，HMGA2在HL-60/DNR細胞中高表達。結(jié)果提示HMGA2可能參與AML多藥耐藥性的產(chǎn)生。鑒于HMGA2的表達特征及在其他腫瘤細胞耐藥性中的作用，我們推測干擾HMGA2基因的表達可能會逆轉(zhuǎn)HL-60/DNR細胞的耐藥性。為了驗證該推論，我們設計了HMGA2的siRNA序列并轉(zhuǎn)染到HL-60/DNR細胞中以干擾HMGA2基因的表達。結(jié)果表明，沉默HMGA2基因的表達可以明顯降低HL-60/DNR細胞的IC50，說明沉默HMGA2基因的表達能逆轉(zhuǎn)HL-60/DNR細胞的耐藥性。這些結(jié)果提示，HMGA2具有作為AML治療靶點尤其是輔助化療靶點的潛能。有研究表明，HMGA2增強了5-氟尿嘧啶對結(jié)腸癌細胞的耐藥性[12]。另外，高表達的HMGA2是預測AML不良預后的獨立預測指標[13]，且干擾HMGA2能增加野生型AML細胞對DNR的敏感性[5]。這些研究報道可進一步支持我們本文的結(jié)論。

另外，我們分析了干擾HMGA2表達對HL-60/DNR細胞衰老的影響。我們發(fā)現(xiàn)沉默HMGA2基因表達能增強HL-60/DNR細胞β-半乳糖苷酶活性。β-半乳糖苷酶活性判定細胞衰老水平的重要指標[14]。當細胞衰老時，衰老相關β-半乳糖苷酶活性水平出現(xiàn)上調(diào)[14]。因此，我們的實驗結(jié)果表明，沉默HMGA2基因表達能加速HL-60/DNR細胞的衰老進程。鑒于細胞衰老能進程能增強腫瘤細胞的化療敏感性，我們推測沉默HMGA2通過加速HL-60/DNR細胞的衰老進程逆轉(zhuǎn)對DNR的耐藥性。

總之，我們發(fā)現(xiàn)HMGA2在耐藥細胞HL-60/DNR中高表達，沉默HMGA2可以逆轉(zhuǎn)HL-60/DNR的DNR耐藥性并加速細胞的衰老。