喀斯特石漠化地區退耕還林對土壤細菌群落的影響

龍家輝，藍家程，姜勇祥

(1.貴州師范大學 地理與環境科學學院，貴州 貴陽 550025； 2.貴州師范大學 喀斯特研究院/國家喀斯特石漠化防治工程技術研究中心，貴州 貴陽 550001)

貴州是中國西南喀斯特分布的中心，也是石漠化最為嚴重的地區。從“九五”開始，國家和地方政府相繼實施了退耕還林和石漠化治理工程，旨在控制石漠化發展，解決生態與社會經濟發展的矛盾。大量研究表明，石漠化治理能夠提高土壤肥力，改善土壤結構，增加土壤有機碳[1-2]。然而，石漠化治理生態修復對土壤微生物群落組成的影響報道尚少。土壤微生物參與有機質的分解、腐殖質的形成、養分的轉化與循環等過程，是土壤有機質和土壤養分(C、N、P、S等)轉化和循環的驅動力[3]，土壤微生物與土壤質量和植物群落的關系密切，可以敏感反應土壤質量的變化[4]。因此，開展喀斯特石漠化地區退耕還林對土壤微生物群落的影響研究，可為喀斯特石漠化區土壤質量恢復和退耕還林選擇模式提供科學依據。

研究表明，隨著退耕還林由低級階段向高級階段發展，土壤微生物數量逐漸提高[4]。喀斯特石漠化區退耕還林對土壤微生物碳、基礎呼吸有重要影響，相對于裸露地，退耕還林顯著提高了微生物量碳、微生物活性、微生物商、細菌種豐富度及基因多樣性[5]。在喀斯特峰叢洼地中由草叢-灌叢-次生林和原生林生態系統，土壤微生物生物量與土壤微生物碳熵呈增加趨勢。隨著植被演替，表層土壤微生物總量為頂級林>灌叢>喬幼林>灌草叢>草叢[6]。

從已有的研究來看，退耕還林對土壤微生物指標的影響大多從自然恢復的角度進行討論，缺乏人工林恢復的研究。人工林恢復和自然恢復模式是否改變了土壤細菌群落豐度和多樣性，是否有利于向生態恢復方向發展尚未報道。筆者以貴州喀斯特石漠化綜合治理示范區關嶺花江示范區為試驗基地，以耕地為對照，選取人工花椒林和自然退耕還林地，運用高通量測序技術，揭示不同退耕還林樣地土壤細菌群落的豐度和多樣性的變化特征，以期為喀斯特退耕還林地區土壤保護提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

研究區位于貴州省關嶺縣花江鎮峽谷村喀斯特峽谷石漠化綜合治理示范區內(105°36′30″～105°46′30″E, 25°39′13″～25°41′00″N)。該區屬典型的亞熱帶干熱河谷氣候，年均降雨量1 100 mm，年均氣溫18.4℃。該區地貌為典型的喀斯特高原峽谷地貌，海拔為450～1 300 m。高原峽谷地貌河谷深切發育，坡度陡峻，水土流失嚴重，巖石裸露率高、植被覆蓋率低，石漠化發育。土壤以碳酸鹽巖風化發育的石灰土為主。

1.2 采樣設計與方法

以耕地(CL)為對照，選取研究區2種退耕還林模式(自然退耕還林SF、人工花椒林CP)為研究對象。每種地類設置3個樣地，每個樣地使用無菌袋采集0～10 cm土層原狀土壤，8～10個點混合為1個點。

1.3 DNA提取及純化

用DNA試劑盒提取土壤DNA。使用Nanodrop 2000光譜儀(Thermo Fisher Scientific，Wilmington，DE，United States)測量提取DNA的濃度和純度。土壤的DNA在使用前一直保存在-20℃。使用引物16S V3～V4區，上游引物338F：ACTCCTACGGGAGGCAGCA，下游引物806R：GGACTACHVGGGTWTCTAAT。通過聚合酶鏈反應(PCR)擴增細菌16S核糖體RNA基因的V3～V4可變區。使用TransGen AP221-02:TransStart-Fastpfu DNA聚合酶進行PCR擴增，并在GeneAmp 9700熱循環儀中進行熱循環。PCR反應程序：95℃預變性3 min；95℃變性30 s，退火溫度30 s，72℃延伸45 s，35個循環；72℃保持10 min。每個樣本3個PCR重復。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增。使用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit凝膠提取試劑盒(United States)純化擴增產物，PCR產物用QuantusTMFluorometer進行檢測定量。使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit進行建庫，最后利用Illu mina公司的Miseq PE300平臺(上海美吉生物醫藥科技有限公司)對細菌16S rRNA基因的V3～V4區進行了測序。

1.4 OUT分類

根據學注稀結果，按照門、綱、屬3個水平分別提取序列信息，并計算各物種的相對豐度，同時選取相對豐度在1%以上的物種繪制物種相對豐度分布圖。

2 結果與分析

2.1 高通量測序數據的優化

質控去除不合格序列后，3個土壤樣品中共獲得細菌總優化序列 2 372 533條。基于97%相似度，樣品CL、CP、SF的OTU數量分別為896 629、757 286和718 618。如圖1所示，當序列數達到12 000以上時，曲線逐漸趨于平緩。測序各樣品測得序列數均遠大于12 000，說明能較好地反映土壤樣品中微生物多樣性的主要信息。Core物種分析曲線隨樣本數量的增加趨于平緩，表明此次檢測樣本數量充足，數據具有可靠性。

2.2 土壤細菌群落分布

由圖2可知，CL獨有物種多集中在放線菌門7.65%，變形桿菌門 1.58%，芽單胞菌門1.16%，酸桿菌門1.07%，綠彎菌門1.02%；CP獨有物種多集中在擬桿菌門2.15%為最多，疣微菌門占有1.27，厚壁菌門1.14%，酸桿菌門1.01%,芽單胞菌門1.01%，Patescibacteria占有1.01%，綠彎菌門1.01%；SF獨有物種多集中在擬桿菌門11.16%為最多，放線菌門3.28%，Entotheonellaeota 2.26%，變形桿菌門5.33%，Patescibacteria 1.46%。3種樣地共有核心物種(在OUT水平下)有2 220個，獨有物種不同，可以說明3種樣地在物種組成上具有明顯差別。

由圖3可知，耕地物種中綠彎菌門(17.79%)顯著比其他樣地多，花椒地物種在酸桿菌門(18.50%)顯著比其他樣地多，喬木林物種在放線菌門(43.44%)、變形桿菌門(24.20%)顯著比其他樣地多。在生態恢復之后，花椒地與耕地相比酸桿菌門具有增加的趨勢(5.4%)，喬木林中的放線菌門、變形桿菌門具有增加的趨勢，分別增加7.75%和3.99%；厚壁菌門、擬桿菌門、已科河菌門變化不顯著；喬木林中芽單胞菌門、綠彎菌門有減少的趨勢，分別減少2.11%和5.92%。表明，退耕還林顯著提高了土壤中的擬桿菌門、放線菌門的相對豐度，降低了綠彎菌門、芽單胞菌門的相對豐度，而退耕種植花椒顯著提高了酸桿菌門的相對豐度。

2.3 土壤細菌群落多樣性

由表1可知，不同植被類型土壤細菌多樣性指數均無顯著差異，樣本中觀察到的物種數目指數、香農-威納指數、辛普森指數、群落中含有OTU數目指數和菌種豐富的指數表現為耕地>花椒>次生林，表明退耕還林對土壤細菌多樣性影響不顯著。基于距離算法對不同退耕還林模式土壤細菌群落組成進行NMDS分析(圖4)表明，3種土地利用類型土壤的細菌群落部分組成存在差異，而在花椒地中的部分與耕地的差異并不明顯，可能的原因是當地花椒種植年限少，部分退耕年限小于5年，群落構建時間短，所以與耕地細菌群落差異性不明顯，而喬木林退耕年限長基本在10年以上，對細菌群落的影響較為顯著。

表1 不同植被類型下土壤細菌多樣性指數特征

3 結論

1) 喀斯特石漠化區退耕還林均使得土壤細菌群落中的獨有物種和核心物種發生了變化。

2) 生態恢復顯著提高了土壤中的擬桿菌門、放線菌門的相對豐度，降低了綠彎菌門、芽單胞菌門的相對豐度，退耕種植花椒顯著提高了酸桿菌門的相對豐度。

3) 生態恢復之后，土壤細菌群落的多樣性并沒有發生顯著變化。

4) 土壤細菌群落組成和豐度相比群落多樣性對退耕還林的響應更為敏感。