肝纖維化小鼠模型中彈性蛋白及其調控因子在肝纖維化形成和逆轉中的分子機制

楊愛婷，嚴旭禛，趙文姍，李為雨，陳 巍，尤 紅

首都醫科大學附屬北京友誼醫院 科研實驗中心，北京市臨床醫學研究所，國家消化系統疾病臨床醫學研究中心，北京 100050

肝纖維化是以細胞外基質(ECM)過度沉積為特征的慢性肝臟疾病[1]。除膠原外，彈性蛋白已被證實在肝纖維化尤其在肝硬化階段大量沉積[1-2]。成熟的彈性蛋白是一種不溶性非極性蛋白，由可溶性單體原彈力蛋白聚合而成[3]。原彈性蛋白分子富含丙氨酸和賴氨酸殘基，它們是交聯反應的主要位點。此外，在成熟的ECM中，分子間交聯增加了彈性纖維的不溶性，使ECM不易被降解，進而限制了纖維化的可逆性。因此彈性蛋白在肝組織沉積可能是部分患者肝硬化無法逆轉的原因[4]，但彈性蛋白在纖維化進展過程中的動態變化尚不清楚。本文旨在動態觀察彈性蛋白在四氯化碳(CCl4)誘導的肝纖維化模型小鼠進展過程中的表達特點，進一步探尋影響彈性蛋白沉積的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選用8周齡雄性C57B6/J小鼠[斯貝福，北京；生產許可證編號：SCXK(京)2014-0006；實驗動物使用許可證編號：SCXK(京)2017-0019]，動物自由進食、飲水，標準飼料顆粒喂食，室溫20 ℃～22 ℃，每12 h明暗循環。

1.2 試劑和儀器 反轉錄試劑盒(Promega公司)、ABI Power SYBR Green PCR Master Mix試劑盒(Applied Biosystems，USA)、彈性蛋白染液(貝索，珠海)、抗彈性蛋白(MAB2503；Millipore，USA)、抗Ⅰ型膠原(PA5-95137，Invitrogen，USA)，7500快速序列檢測器(Applied Biosystems，USA)、Fastin ElastinTMAssay(Biocolor life science assays，UK)、SircolTMInsoluble Collagen Assay(Biocolor life science assays，UK)、LC-MS/MS-IT-TOF高效液質聯用色譜儀(Shimadzu，Japan)。

1.3 實驗方法

1.3.1 小鼠CCl4肝纖維化形成及自發逆轉模型的建立將CCl4溶于橄欖油(CCl4和橄欖油按1∶7體積混合)，給予0.2 ml/100 g腹腔注射，2次/周，連續8周。纖維化進展期組分別于CCl4腹腔注射的第4周和8周末處死小鼠；自發逆轉組為8周后停止CCl4注射，在CCl4停止后的第4、6、8、12周末分別處死小鼠[小鼠共30只，根據每個時間點分為6組，分別為進展4周組、進展6周組、進展8周組(逆轉0周組)、逆轉4周組、逆轉8周組、逆轉12周組，每組5只]。健康對照組注射0.2 ml/g橄欖油共8周后處死。收集血清、肝臟標本待檢測。

1.3.2 肝臟組織病理學染色檢查 所有收集的肝臟標本均以4%多聚甲醛溶液固定，經乙醇脫水后石蠟包埋。通過天狼星紅染色檢測膠原沉積，顯微鏡下觀察以確定肝臟纖維化程度，分為早期肝纖維化以及進展期肝纖維化。通過維多利亞藍檢測彈性蛋白沉積，將切片漂白后，在彈性蛋白染液中浸泡24 h，脫水后中性樹膠封片。應用免疫組織化學染色法檢測Ⅰ型膠原。

1.3.3 Western Blot檢測肝臟組織彈性蛋白和Ⅰ型膠原蛋白 取肝組織20 mg制備蛋白樣品。每組取總蛋白20 μg上樣，12%SDS-PAGE分離蛋白質，將蛋白轉至硝酸纖維素膜上，室溫封閉2 h，分別加入抗彈性蛋白一抗(1∶1000)和抗Ⅰ型膠原一抗(1∶1000)，4 ℃孵育過夜，充分洗滌后二抗室溫孵育1 h，充分洗滌后，發光、曝光、掃描。以抗β-肌動蛋白抗體作為上樣對照。

1.3.4 實時定量聚合酶鏈反應(qPCR) 檢測賴氨酸氧化酶-1(LOXL-1)和Fibulin-1(FBLN-1)用Trizol法提取肝組織中總RNA，使用反轉錄試劑盒得到20 μl cDNA。通過ABI Prism 7500快速序列檢測器和ABI Power SYBR Green PCR Master Mix試劑盒進行qPCR反應。

1.3.5 不可溶彈性蛋白與不可溶膠原測定 不可溶彈性蛋白與不可溶膠原分別通過Fastin ElastinTMAssay和SircolTMInsoluble Collagen Assay測定。交聯的彈性蛋白(在肝組織中不可溶解)通過草酸進行熱萃取處理，重復熱萃取3遍以徹底溶解交聯的彈性蛋白。沉淀，離心并與染料試劑結合后，取彈性蛋白-染料復合物沉淀溶于溶液后在513 nm下測量。不可溶膠原的測定方法與之類似。所有樣品一式兩份以減少誤差。

1.3.6 LC-MS/MS鑒定小鼠血清中纖維化進展期和動態逆轉期相關的蛋白 將提取的血清去除高豐度蛋白，經Bradford法測定濃度后，制備蛋白樣品。進行12% SDS-PAGE電泳上分離蛋白質，考馬斯亮藍染色凝膠1 h后，分為5個餾分，解剖刀將膠帶切成1～2 mm2大小的膠片，進行脫色后加入三氟乙酸溶液提取。將高pH反相分離得到的組分用20 μl 2%甲醇、0.1%甲酸復溶，13000 r/min離心后取10 μl上清上樣，以分離梯度流速350 nl/min進行液相分離后，進行質譜分析。使用小鼠Uniport蛋白序列庫匹配鑒定分析陽平蛋白。將無重復實驗的條件下，蛋白的豐度比即差異倍數達到2倍以上，且在逆轉過程中隨時間逐漸升高或降低的蛋白，視作顯著差異蛋白。

1.4 倫理學審查 本研究方案經由北京友誼醫院實驗動物倫理委員會審批(批號：15-2004)，符合實驗室動物管理與使用準則。

2 結果

2.1 彈性蛋白在肝纖維化模型中的表達特征 首先動態觀察彈性蛋白在健康對照組、CCl4注射4周(早期纖維化)和8周(進展期纖維化)變化，同時與Ⅰ型膠原進行比較。如下圖1a所示，與健康對照組相比Ⅰ型膠原隨纖維化的進展表達逐漸升高(P值均<0.05)；進展期纖維化組彈性蛋白與健康對照組相比顯著升高(P<0.05)。肝臟病理學Ⅰ型膠原免疫組化染色和彈性蛋白染色的結果提示，與健康對照組相比，早期纖維化組及進展期纖維化組的Ⅰ型膠原陽性面積差異均有統計學意義(P值均<0.05)；早期纖維化組及進展期纖維化組彈性蛋白染色陽性面積差異亦均有統計學意義(P值均<0.05)(圖1b)。進一步對不可溶膠原和不可溶彈性蛋白的檢測發現，不可溶性膠原隨著纖維化進展含量逐漸升高，而不可溶性彈性蛋白僅在進展期纖維化時大量積聚(圖1c)。考慮到彈性蛋白酶12(MMP12)是參與彈性蛋白降解的關鍵基質酶，進一步檢測了MMP12的基因表達(圖1d)，結果發現MMP12的基因表達水平隨纖維化進展顯著升高(P值均<0.05)。

2.2 自發肝纖維化逆轉模型的建立 成功建立小鼠肝纖維化逆轉模型。天狼星紅染色結果顯示，在小鼠經CCl4注射8周后，開始出現假小葉，間隔連接較為緊密；當停止注射，自發逆轉4周后，假小葉結構逐漸消失，纖維間隔變得松散；自發逆轉12周時，假小葉基本消失，僅有輕微竇周纖維化(圖2)。

2.3 LOXL-1和FBLN-1與肝纖維化疾病相關 使用雙向電泳和LC-MS/MS分離并識別血清中與纖維化逆轉相關蛋白。共識別篩選出45種表達差異的蛋白，其中25種蛋白隨纖維化逆轉逐漸升高，20種在蛋白隨纖維化逆轉逐漸降低(圖3)。LOXL-1和FBLN-1參與彈性蛋白沉積。經qPCR證實，LOXL-1和FBLN-1的基因水平在CCl4注射8周達到高峰，且隨著逆轉時間的延長表達逐漸下降(圖4)。

3 討論

CCl4是一種選擇性肝化學毒物，其可通過損害肝細胞，破壞肝細胞中各種成分模擬慢性肝損傷。通過持續注射CCl4誘導肝纖維化模型已成為最常見且最方便的方式之一[5]，該方法具有操作簡單、時間短、成模率高等特點。實驗動物的病死率與CCl4劑量成正相關。本研究以小劑量CCl4腹腔注射8周，成模率為100%，沒有小鼠死亡。同時在停止CCl4注射后，肝細胞可憑借其再生功能恢復其肝組織結構和肝臟功能，這一特征可很好的建立肝纖維化逆轉模型。在本實驗中，CCl4注射8周后可見典型的肝纖維化組織學特征，如假小葉，緊密的纖維間隔形成。當停止CCl4注射后，經過4、8、12周的自然恢復，肝臟組織學基本恢復正常，假小葉消失，纖維間隔基本消散。

既往人們主要針對ECM中膠原成分研究其分泌和降解過程。大量研究已經證實膠原的沉積與纖維化嚴重程度明顯正相關，可以作為評估纖維化嚴重程度的指標。但因為膠原的沉積發生在纖維化發生的任何階段，很難定量評估纖維化逆轉的難易程度。最近的研究[6]發現，當ECM中有彈性蛋白的沉積時，ECM很難被降解。

彈性蛋白是彈性纖維的主要成分，是一種不可溶性蛋白，在正常肝組織的血管壁和匯管區都有彈性蛋白的存在，但在纖維化和肝硬化時數量明顯增加[4]。彈性蛋白以原彈性蛋白的形式釋放，是水溶性蛋白，一旦從細胞釋放出來，彈性蛋白形成交聯，變成不可溶性，增加了對彈性蛋白酶(巨噬細胞金屬彈力酶)抵抗性。彈性蛋白在MMP12的作用下可以降解，形成可溶性肽[7]。

本研究發現，與膠原在隨肝纖維化進展而緩慢升高的模式不同，彈性蛋白在早期纖維化中表達并未明顯升高，僅在纖維化末期表達顯著升高。這一結果提示在纖維化早期時I型膠原率先開始在肝臟中沉積，而到了纖維化末期，為了維持膠原交聯的穩定，彈性蛋白開始大量聚集。同時，不可溶彈性蛋白含量測定結果與Western blot結果一致，不可溶彈性蛋白僅在纖維化末期含量明顯升高。另外，MMP12是彈性蛋白降解的關鍵基質酶。本研究發現在纖維化進展過程中MMP12表達增加，提示形成交聯的彈性蛋白增加了對彈性蛋白的抵抗力，使彈性蛋白酶很難發揮對彈性蛋白的降解作用。同時新生彈性蛋白不斷產生，這有可能是導致肝纖維化在去除病因后仍難以逆轉的原因。

本研究與既往研究表明，彈性蛋白與膠原表達模式不同，纖維間隔中的彈性蛋白只出現在纖維化成熟階段，提示纖維化逆轉的難度增加[8]。因此，調控彈性蛋白積聚可成為解決肝纖維化難以逆轉的重要靶點之一，但是目前仍缺乏直接的證據說明調控彈性蛋白沉積的重要調節因子。LC-MS/MS可有效的分離待測物品與干擾物，提高靈敏度，十分適用于分析血清中各個組分變化，可明確調控彈性蛋白的關鍵分子。利用本實驗中共篩選出45種差異表達蛋白，25種蛋白在逆轉后逐漸升高，20種蛋白在逆轉后逐漸降低，其中包括LOXL1和FBLN-1與彈性蛋白沉積相關蛋白。經過RT-PCR驗證后提示LOXL-1和 FBLN-1在纖維化進展中表達增高，且在逆轉過程中表達降低。FBLN-1 屬于纖維蛋白家族，該家族是一個糖蛋白家族，他們都可以與原彈性蛋白相結合。已有研究[9]表明在成纖維細胞中，FBLN-1可通過與FBLN-5相結合沉積在彈性蛋白上，促進彈性蛋白在ECM中的沉積。在肝癌細胞中，MMP13可直接水解FBLN-1[10]，但是未有研究表明降解彈性蛋白的MMP12以及其余成員可直接作用于FBLN-1。同時，FBLN-1不僅可以在大鼠門靜脈區檢測到，同時在急性肝損傷的肝臟中表達也大量增加，特別是肝細胞和活化的肝星狀細胞中[11]。另外，LOXL-1屬于賴氨酰氧化酶家族，主要參與膠原的交聯[12]。在LOXL-1敲除的小鼠中，MMP2、MMP9、MMP12表達顯著升高[13]，彈性蛋白降解可能因此增多。也有研究[14]表明，在血管平滑肌細胞中LOXL-1可通過與FBLN-5相結合，調控原彈性蛋白的組裝。目前，干預LOXL-1或FBLN-1后是否可以發揮MMP12對彈性蛋白降解的作用，加速彈性蛋白的降解，從而阻止纖維化進展或者促進肝纖維化的逆轉還有待于進一步研究。因此，上述證據表明，FBLN-1與LOXL-1為肝纖維化中彈性蛋白降解的重要調節因子。

綜上所述，本研究通過成功建立肝纖維化模型，發現彈性蛋白僅在肝纖維化末期表達明顯增加，同時不可溶彈性蛋白含量升高，揭示晚期肝硬化難以逆轉的原因。同時通過LC-MS/MS與RT-PCR驗證，發現FBLN-1與LOXL-1可能是調控彈性蛋白降解的重要因子。LOXL-1和FBLN-1介導的彈性蛋白降解有可能成為肝纖維化特別是肝硬化和終末期肝病的治療靶點。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突，特此聲明。

作者貢獻聲明：楊愛婷、嚴旭禛負責課題設計，資料分析，撰寫論文；趙文姍、李為雨、陳巍參與收集數據，修改論文；尤紅負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。