基于亞甲基藍的近紅外熒光探針用于HOCl的特異性檢測

姚書帆，堯雨斯，鄭武斌，葉晨喆，應 杰，呂光磊，李春霞

(浙江師范大學 化學與生命科學學院，浙江 金華 321004)

1 引 言

活性氧(Reactive oxygen species，ROS)是介導多種生物過程的重要信號分子[1-3]。次氯酸(HOCl)/次氯酸鹽(-OCl)是一種由過氧化氫和氯離子在髓過氧化物酶(MPO)催化作用下產(chǎn)生的ROS[4]。HOCl在機體抵抗病原體的免疫防御中起著至關重要的作用[5]。人們發(fā)現(xiàn)，HOCl不僅可以清除先天免疫系統(tǒng)中的病原體和微生物，而且在調(diào)節(jié)細胞內(nèi)氧化還原平衡中起著重要作用，并參與多種信號傳導過程[4]。盡管如此，越來越多的證據(jù)表明過量的HOCl會導致細胞和器官的氧化應激，從而引發(fā)很多疾病，例如帕金森病[6]、類風濕性關節(jié)炎[7]、肝損傷[8]和癌癥等[9]。因此，開發(fā)一種可靠、精準以及能夠在生理水平條件下檢測HOCl的分析方法至關重要。

內(nèi)源性HOCl具有很高的活性，能與其他生物分子和抗氧化劑迅速反應，給跟蹤和分析其在生物體內(nèi)的生理功能帶來了巨大挑戰(zhàn)[2,10]。在過去的幾十年里，科學家們已經(jīng)開發(fā)了一些檢測HOCl的方法，如電分析法、色譜法、化學發(fā)光法和熒光分析法[11-14]。其中熒光探針以其簡單、快速、高選擇性、高靈敏度和實時檢測等突出優(yōu)點，被證明是最有效的非侵入性和原位識別HOCl的方法[15-22]。

近年來已經(jīng)有一些有機小分子熒光探針被廣泛應用于HOCl檢測，按發(fā)光母核的不同大致可以分為：BODIPY[23-26]、萘酰亞胺[27-28]、羅丹明[20,29]、香豆素[30]等。許多熒光探針能夠在體外或在細胞中檢測HOCl，但由于發(fā)射波長較短，使其在活體中的檢測受到了限制[31-36]。與可見光熒光探針相比，近紅外(NIR)熒光探針具有一些顯著的優(yōu)勢，如較高的組織穿透深度和較低背景熒光等[37-41]。因此，迫切需要開發(fā)出具有檢測生物體中HOCl的近紅外熒光探針，而構(gòu)建“turn-on”熒光探針是檢測HOCl的一種重要策略，其具有高的靈敏度和信噪比。

本文以亞甲基藍(Methylene blue，MB)[42]為熒光母核，利用其還原形式(RMB)和氧化形式(LMB)之間的熒光變化，設計合成了一種近紅外熒光探針MB-1用于HOCl的檢測。該探針可在體外特異性檢測HOCl，伴隨著顯著的近紅外熒光強度的增強和顏色從無色到藍色明顯的變化，在HOCl的分析檢測方面具有良好的應用潛力。

2 實 驗

2.1 試劑與儀器

實驗過程中使用的所有試劑和溶劑均來自商業(yè)供應商(表1)，未經(jīng)進一步純化。

表1 藥品和溶劑

在乙腈或乙醇(HPLC級)中制備探針MB-1的儲備溶液(1 mmol/L)，并進一步用PBS(磷酸鈉緩沖液，pH=7.4)稀釋至最終濃度(10 μmol/L)。根據(jù)文獻報道的方法合成活性物種[43]。所用材料包括叔丁基過氧化氫(TBHP)、5%NaOCl溶液、30%H2O2溶液、硝基鐵氰化鈉(Ⅲ)二水合物(SNP)、2,2′-偶氮二(2-脒基丙烷)二鹽酸鹽、超氧化鉀(KO2)、3-嗎啉代嘧啶鹽酸鹽和亞鐵硫酸鹽，在超純水或二甲基亞砜(DMSO)中制備ROS或活性氮物質(zhì)(RNS)。自由基(·OH和TBO·)由芬頓反應生成：在H2O2(1 eq)存在下加入FeSO4(5 eq)制備·OH，在TBHP(1 eq)存在下加入FeSO4(5 eq)制備TBO·。最后在PBS緩沖溶液中稀釋到設定的濃度進行測試。

在F-4600熒光分光光度計上測量了探針在HOCl存在時熒光強度的變化，激發(fā)波長λex=620 nm。探針的吸收光譜在UH 5300紫外-可見分光光度計上進行測量。1H NMR(400 MHz)和13C NMR(100 MHz)在Bruker AV-400或AV-600 NMR光譜儀上進行測量。使用TOF MS儀器進行高分辨率質(zhì)譜(HRMS)分析。

2.2 探針的合成步驟

MB-1的合成(圖1)：向MB(1.00 g，3.13 mmol，1.0 eq)的10 mL水溶液中加入二氯甲烷(DCM，5 mL)和Na2CO3(1.33 g，12.52 mmol，4.0 eq)。在氮氣氣氛下，將上述混合溶液于40 ℃持續(xù)攪拌。接著，使用注射器將溶于水中的連二亞硫酸鈉(10.89 g，12.52 mmol，4.0 eq)直接注入混合溶液中。然后，在氮氣氣氛下，將反應溶液于40 ℃持續(xù)攪拌1 h，直到溶液變?yōu)辄S色。用冰水浴對溶液進行冷卻，然后向里面滴加溶于5 mL二氯甲烷中的雙(三氯甲基)碳酸酯(0.56 g，1.88 mmol，0.6 eq)。添加完畢后，在氮氣氣氛下，將混合物于室溫下攪拌2 h。最后，將反應溶液倒入100 mL冰水中，并用DCM進行萃取。通過合并有機相，萃取物用無水硫酸鈉干燥后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸發(fā)除去溶劑，然后通過柱色譜法純化得到化合物MB-Cl(白色固體，產(chǎn)率為48.2%；乙酸乙酯/正己烷=1/10)。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ=7.42(s，2H)，6.72(s，2H)，6.65(d，J=8.0 Hz，2H)，2.98(s，12H)。

向100 mL的schlenk管中加入化合物MB-Cl(50.0 mg，0.144 mmol)、Na2CO3(61.4 mg，0.576 mmol)、N,N-二甲基苯胺(78.6 mg，0.576 mmol)，加入溶劑二氯甲烷(5.0 mL)。在40 ℃條件下，對反應液進行薄層色譜跟蹤直至反應完全。反應結(jié)束后，反應液冷卻到室溫，減壓濃縮，柱層析分離提純得到化合物MB-1(黑色固體，產(chǎn)率為58.3%；乙酸乙酯/石油醚=1/1)。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ=7.43(d，J=8.2 Hz，2H)，7.23(d，J=7.5 Hz，2H)，6.75(s，1H)，6.71(s，2H)，6.65(s，4H)，2.92(s，12H)，2.86(s，6H)。13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ=153.7，149.0，147.5，134.3，128.7，128.2，127.2，121.6，113.4，111.3，111.0，41.2，40.7。HR-MS(ESI，m/z): calcd for C25H29N5OS [M+H]+，448.214 3，found 448.212 6。

圖1 MB-1的合成路線

2.3 檢出限的測定

根據(jù)常用的熒光滴定法確定檢測限(LOD)。通過收集11次探針(10 μmol/L)在PBS緩沖液中的發(fā)射光譜以確認其標準偏差(σ)。然后，根據(jù)HOCl在0.0～4.0 μmol/L范圍內(nèi)686 nm處的熒光滴定數(shù)值擬合線性回歸曲線，并獲得曲線的斜率(k)。最后，使用以下公式計算檢出限：D=3σ/k。

3 結(jié)果與討論

3.1 探針對HOCl的響應性

如圖2，探針MB-1本身基本無熒光，但在HOCl存在條件下，缺電子的酰胺羰基處很容易受到攻擊從而斷裂生成熒光團MB。基于此，我們認為MB-1具有實時檢測HOCl的潛在能力。為進一步研究探針對HOCl的響應特性，我們在室溫下的PBS溶液中記錄了相應的光譜信號。如圖3(b)所示，添加HOCl后，探針在686 nm處顯示出顯著的熒光發(fā)射增強，并且當添加10 μmol/L的HOCl時，探針MB-1的熒光強度增強倍數(shù)達到最大，為198倍。接著，使用熒光滴定法測試了探針的檢出限(HOC1濃度范圍為0.0～4.0 μmol/L)，MB-1的檢測限低至8.2 nmol/L(圖3(c)、(d))。除此之外，我們還通過吸收滴定方法測得其檢測限為62 nmol/L(圖3(e)、(f))，遠大于8.2 nmol/L，進一步說明熒光檢測法比吸收光譜的靈敏度高。此外，與熒光強度變化同步發(fā)生的是溶液顏色變化，加入HOCl后，溶液由無色變?yōu)轱@著的藍色(圖2)。因此，該探針可以作為HOCl的“裸眼”指示劑。上述結(jié)果表明，MB-1探針對溶液中的HOCl具有較高的敏感性。

圖2 MB-1與HOCl反應示意圖，插圖為探針與HOCl反應前后溶液顏色變化。

圖3 (a)在HOCl(10 μmol/L)存在下，MB-1(10 μmol/L)在PBS中的紫外-可見吸收光譜；(b)在不同濃度的HOCl(0, 2.5,5.0,7.5,10 μmol/L)存在下，MB-1(10 μmol/L)在PBS中的熒光光譜；(c)在PBS緩沖液中用HOCl(0.0～4.0 μmol/L)進行連續(xù)滴定，探針MB-1(10 μmol/L)的發(fā)射光譜；(d)根據(jù)HOCl從0.0～4.0 μmol/L范圍內(nèi)MB-1在686 nm處的熒光強度進行線性回歸曲線擬合；(e)在PBS緩沖液中用HOCl(0～10 μmol/L)進行連續(xù)滴定，探針MB-1(10 μmol/L)的吸收光譜；(f)根據(jù)HOCl從0～10 μmol/L范圍內(nèi)MB-1在665 nm處的吸收值進行線性擬合。PBS(pH=7.4)，λex=620 nm，λem=686 nm。

3.2 探針對HOCl的選擇性

圖4 在PBS溶液(pH=7.4)中存在各種分析物(100 μmol/L)下探針MB-1(10 μmol/L)在686 nm處的熒光響應。(a)添加不同的ROS/RNS(從A到和H：HOCl；(b)添加各種陰離子(從A到和I：HOCl；(c)添加各種陽離子(從A到和J：HOCl；(d)添加各種氨基酸(從A到O：Pro、Ser、Ala、Gln、Val、Thr、lle、Gly、Tyr、Met、Trp、Phe、Cys、Glu、Lys)和P：HOCl。激發(fā)和發(fā)射波長(λex/λem)分別為620/686 nm。

3.3 探針的抗干擾能力

生物體內(nèi)不只含有HOCl，為驗證該探針具有應用于生物體的潛力，我們研究了加入其他還原劑(包括N-乙酰半胱氨酸(NAC)、谷胱甘肽(GSH)、葡萄糖和醛)的情況下探針的抗干擾能力。如圖5，高濃度的葡萄糖和醛(0.5 mmol/L)不會干擾探針對HOCl的檢測，而由于NAC和GSH能在一定程度上消耗HOCl，隨著它們濃度的逐漸增加，探針的熒光發(fā)射強度有所降低，但即使在分別存在20 μmol/L NAC和GSH情況下，探針的熒光強度仍比僅存在探針本身時增加了13倍和6倍。此外，不同pH值對探針檢測HOCl的影響也是我們要考慮的情況之一。如圖6，我們檢測了探針MB-1在pH=2～12的PBS溶液中與HOCl(10 μmol/L)反應后的熒光強度。結(jié)果表明，在10 μmol/L的HOCl存在下，探針的熒光發(fā)射強度在5～11的pH范圍內(nèi)均顯示出顯著的熒光發(fā)射增強。綜上所述，探針MB-1在復雜的溶液環(huán)境中具有出色的抗干擾能力，表明它具有能夠在生理水平上進行HOCl檢測的可能。

圖5 幾種細胞還原劑對MB-1(10 μmol/L)響應HOCl的干擾。(a)NAC；(b)GSH；(c)HCHO；(d)葡萄糖。激發(fā)和發(fā)射波長(λex/λem)分別為620/686 nm。

圖6 在不存在和存在HOCl(10 μmol/L)情況下，pH對MB-1(10 μmol/L)在686 nm處熒光強度的影響。激發(fā)和發(fā)射波長(λex/λem)分別為620/686 nm。

4 結(jié) 論

本文基于亞甲基藍的結(jié)構(gòu)，設計合成了探針分子MB-1用于HOCl的檢測。MB-1對HOCl具有良好的特異性、較低的檢測限和較好的抗干擾能力，可以實現(xiàn)微量HOCl的特異性檢測。另一方面，本文還提供了一種設計思路：通過調(diào)整苯胺對位官能團的取代基可以設計合成一系列對HOCl響應的探針分子。該類探針可為檢測病變組織部位的HOCl提供可能。該探針也存在一些不足，如只能在HOCl濃度范圍比較窄的區(qū)間內(nèi)進行定量測定以及探針對HOCl的響應時間相對較長等。這些都是我們今后需要改進和完善的問題。