“提取、測定茶葉中咖啡因”綜合性實驗項目的設計

張艷軍，廖日權，王 蕓，鐘書明，張瑞瑞，陳 怡

(北部灣大學 石油與化工學院，廣西 欽州 535000)

1 引言

咖啡因是一種生物堿，能溶于乙醇、丙酮等有機溶劑，存在于茶葉中[1-2]。“從茶葉中提取咖啡因”是有機化學實驗課程中開設的一個實驗性項目，實驗利用索氏提取法對天然產物中有效成分進行提取[3]。在索氏抽提過程中判斷提取是否完全主要看顏色的變化，不同的學生判斷標準不一樣，無法準確判斷抽提是否完成；最后通過升華得到純品，由于升華過程中溫度控制難度比較大，可能會最終導致得到咖啡因量少，無法準確得到其中咖啡因的含量[4-5]。而“高效液相色譜法測定飲料中的咖啡因含量”是儀器分析實驗中的一個實驗項目，利用高效液相色譜儀對天然產物有效成分的含量進行測定[6]。通過把二個實驗相結合，設計成一個綜合性實驗，該綜合實驗的開設使學生能夠掌握天然產物有效成分的提取工藝和含量測定。開設綜合性設計性實驗有助于鍛煉學生的創新思維、創新能力及綜合素質的培養[7-8]。索氏提取工藝設計通過設定溶劑濃度、提取時間、提取溫度、溶劑用量等因素，采取單因素和正交試驗考察這些因素對咖啡因得率的影響[9]，利用HPLC法檢測咖啡因含量。

2 實驗部分

2.1 儀器和試劑

高效液相色譜儀1260 (美國安捷倫)，色譜柱：ODS-C18柱 (4.6×250mm，5μm)，甲醇為色譜純(fisher公司)。

2.2 標準曲線的繪制

稱取升華實驗獲取咖啡因(色譜純)標準品20mg于100mL容量瓶中，用甲醇溶解配制成(200μg/mL)咖啡因標準儲備液，分別吸取0.1，0.5，1.0，2.0，5.0mL儲備液于10mL容量瓶中，配制成濃度為2，10，20，40，100μg/mL的標準曲線系列溶液，以標準工作液的質量濃度(x)為橫坐標，以峰面積(y)為縱坐標，繪制出咖啡因標準工作曲線[10]。

2.3 咖啡因得率計算

精密吸取咖啡因提取液0.5mL于10mL容量瓶中，以同濃度乙醇進行定容混勻后，設定流動相甲醇∶水=40∶60，紫外檢測器波長280nm，柱溫為30℃的條件下測定其提取液的峰面積，平行測定三次取平均值。根據測得的峰面積及咖啡因標準工作曲線由公式(1)計算得到樣品液中咖啡因的得率。

樣品中咖啡因得率按公式(1)計算：

咖啡因得率= (N×C×V)/M×100%

(1)

式子中N為咖啡因提取液的稀釋倍數；C為咖啡因提取液的質量濃度(μg/mL)；V為咖啡因提取液稀釋前的總體積(mL)；M為茶葉的質量(g)。

2.4 實驗方法

2.4.1 單因素實驗

HPLC法測定，以咖啡因得率為參考指標，通過研究提取溫度、提取時間、溶劑濃度、料液比各因素條件的改變對咖啡因得率的影響，得出最佳提取工藝條件，具體單因素設定如下：

(1)提取溫度對咖啡因得率的影響：提取時間2h、溶劑濃度90%、料液比1∶50作為固定條件保持不變。分別設定提取溫度60，70，80，90，100 ℃這五個水平來實驗。判斷提取溫度對咖啡因得率的影響。

(2)提取時間對咖啡因得率的影響：最佳提取溫度、溶劑濃度90%、料液比1∶50作為固定條件保持不變。分別設定提取時間1，2，3，4，5這五個水平來實驗。判斷提取時間的不同對咖啡因得率的影響。

(3)溶劑濃度對咖啡因得率的影響：最佳提取溫度、最佳提取時間、料液比1∶50作為固定條件不變。分別設定溶劑濃度60%，70%，80%，90%，100%這五個水平來實驗。判斷溶劑濃度的不同對咖啡因得率的影響。

(4)料液比對咖啡因得率的影響：以最佳提取溫度、提取時間、溶劑濃度作為固定條件不變。分別設定料液比1∶45，1∶50，1∶55，1∶60，1:65g/mL這五個水平來實驗，判斷料液比的不同對咖啡因得率的影響。

2.4.2 正交試驗

根據單因素結果，設計正交試驗法獲取最佳提取工藝條件。根據提取溫度、提取時間、溶劑濃度、料液比、設計四因素三水平正交試驗，采用L9(34)正交表進行試驗，根據正交試驗數據分析得出咖啡因的最佳提取工藝參數。

3 結果與討論

3.1 咖啡因標準曲線

利用HPLC，得到咖啡因標準曲線如圖1所示，線性方程為y = 22.83x +2.9903，R2=0.9994。在咖啡因2～100μg/mL的濃度范圍內與峰面積呈良好線性關系。

圖1 咖啡因標準曲線

3.2 單因素實驗結果分析

3.2.1 提取溫度對咖啡因得率的影響

如圖2所知，在提取溫度為60～90℃時，咖啡因得率逐漸增大，這說明適當的溫度提升有利于咖啡因加速溶解；當提取溫度達到90℃，咖啡因得率達到最佳；若提取溫度繼續升高至100℃時，得率出現明顯降低，此時醇溶性雜質由于過高溫度而大量溶出[11]，與咖啡因競爭溶于乙醇-水體系，從而干擾咖啡因溶解。并且溫度過高，加速了溶劑乙醇的揮發。故此，得到最佳提取溫度為90℃。

圖2 提取溫度對咖啡因得率的影響

3.2.2 提取時間對咖啡因得率的影響

如圖3所示，當提取時間在3h內，咖啡因的得率保持上升；當提取時間為3h，咖啡因的得率呈最大，達1.77%；但超過3h后，得率反而下降。這可能是因為提取時間過短，溶液中咖啡因未溶解平衡，溶解較少，得率低；若提取時間過長，咖啡因易發生分解及其他損失，得率也會降低，由此可確定得到最佳提取時間為3h。

圖3 提取時間對咖啡因得率的影響

3.2.3 溶劑濃度對咖啡因得率的影響

如圖4所示，當溶劑濃度在60%～90%范圍內時，咖啡因的得率呈增長趨勢；溶劑濃度為90%時，咖啡因得率最大，因為咖啡因為非極性小分子化合物，基于相似相溶原理，咖啡因的溶解度隨著乙醇濃度的提高而提高；但當溶劑濃度為100%時，咖啡因的提取率明顯降低，無水熱乙醇更易揮發導致溶劑的減少，咖啡因的溶解度因此下降。故而確定乙醇90%為最佳溶劑濃度。

圖4 乙醇濃度對咖啡因得率的影響

3.2.4 料液比對咖啡因得率的影響

如圖5所示，隨著料液比的增加，咖啡因的得率顯著提高，當料液比達到1∶55時，此時咖啡因得率達到2.12%；但若料液比繼續增加時，咖啡因的得率無明顯變化。這是因為料液比較小時，提取液中咖啡因濃度較大，由于分子擴散速度低導致咖啡因得率小，隨著溶劑量的提高，茶葉中更多的咖啡因被溶解釋放出來，但茶葉中所含的咖啡因是一定的，多數咖啡因被析出之后溶劑量的再增加對最終提取效果影響不大。基于提取效果及經濟成本的角度出發，可以確定最佳料液比為1∶55。

圖5 料液比對咖啡因得率的影響

3.3 正交試驗結果

本實驗考察四個因素和三個水平，故此選擇L9(34)進行正交試驗。實驗設計及結果由表1、表2所示。

表1 L9(34)正交表

表2 正交試驗結果及分析表

由表2中K值分析確定得到提取咖啡因的最佳組合A2B2C2D2，由R值確定上述因素在咖啡因提取實驗中的影響次序為提取溫度>料液比>提取時間>溶劑濃度，本實驗最佳提取條件為：提取溫度90 ℃，提取時間3 h，溶劑濃度90%，料液比1∶55 (g/mL)，該條件下咖啡因得率達2.13%。

4 結語

將有機化學實驗“咖啡因的提取”和儀器分析實驗“咖啡因的測定”實驗教學內容相結合，既形成一個系統的、完整的實驗過程，又體現出有機化學與儀器分析之間的交叉融合。使學生掌握有機化學中天然產物的提取同時，也掌握了液相色譜儀對有機物的定性、定量分析，對液相色譜儀的結構、原理及用途有了更直觀的認識。綜合性實驗教學內容的設計，可培養學生多角度思考問題、開拓學生的思維。有助于學生綜合解決問題能力、創新能力等綜合素質培養，同時也為學生今后開展科學研究提供思路。