放線菌菌株HJG-5生防劑型的研制及對黃瓜枯萎病的防治效果

李鴻坤，米佳雯，池 明，劉慧芹，王遠宏，單慧勇

(1.天津農學院 園藝園林學院，天津 300384；2.天津農學院 技術工程學院，天津 300384)

在現代農業生產中，由于過分追求高產、優質和高效，改變了傳統的種植制度，從而導致生態失衡，引發園藝植物土傳病害發生加劇[1-2]。黃瓜枯萎病是園藝植物土傳病害的重要代表，嚴重影響黃瓜產量與品質，是導致黃瓜連作障礙的主要因素之一[1]。化學農藥是防治土傳病害最常用的方法，但是長期使用化學農藥導致的環境污染、食品安全、農藥殘留等問題日益突顯。生物防治因其成本低、來源廣及對環境友好等特點，成為當前國內外防治植物土傳病害的研究熱點。篩選和構建具有綜合優良性能的拮抗菌株、開展生防菌劑研發已成為植物病害生物防治的重要發展方向[2-3]。

放線菌具有防效好、作用譜廣、生物多樣性強、產生抗生素種類豐富的特點，已被廣泛應用于植物病害防治[4-6]。中國很早就開展了“5406”抗生菌的研究，用來防病、保苗和增產，并得到廣泛的應用，以放線菌開發的井岡霉素、多效霉素、農用鏈霉素等生物農藥為農業生產帶來巨大的效益[6-8]，但大量單一使用抗生素會導致病原物抗性增加，也會對人類造成危害。放線菌的活體制劑能夠避免或弱化這些弊端，但放線菌活菌制劑受環境因素影響極大，2000年美國公布的46種生防菌活菌制劑中，只有1種是放線菌，放線菌菌劑的數量非常有限，到目前仍然約有90%的放線菌資源尚未得到有效的開發[9]，放線菌活菌制劑的研制仍然是其開發應用中亟待解決的問題 之一。

固體發酵是活菌制劑較為傳統的發酵方式，具有生產設備相對簡單、生產成本低、產量大及利于保存等特點而受到人們的青睞[10]。放線菌具有一定的耐熱和抗干燥特性，經熱處理和干燥處理后可大大降低細菌的干擾，獲得更多更純的活菌，適于固體發酵的生產方式。冀媛媛等[11]、梁春浩等[12]、Arora等[13]學者均通過固體發酵提高了放線菌的產量或活性。在發酵生產、制劑加工、儲備和實際應用方面，不同的微生物菌劑均有明顯差別，但研制的劑型應該能最大限度地發揮生物的功效[11-14]。目前，國內外市場中活菌制劑大多集中在芽孢桿菌中[15]，而放線菌則大多集中在抗生素、酶及其代謝物的利用方面[10,16]，其活菌制劑的相關研究鮮為報道。內生放線菌HJG-5是一株分離自花椒根部的肉桂栗色鏈霉菌(Streptomycescinnamocastaneus)，對環境適應能力強，有較強的植物根表和根圍土壤定殖能力，對多種植物病原真菌具有較強的抑制作用[17]，由中國科學院微生物研究所保藏(專利保存號：CGMCC No.14969)。為了進一步提高其發酵效能和挖掘其生防潛力，本試驗開展了菌株 HJG-5的固體發酵及菌劑研制，并開展了對黃瓜枯萎病的防效試驗，以期為植物病害的田間防治提供理論依據以及菌劑的研制開發提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 供試材料

菌株：內生放線菌菌株HJG-5由山西農業大學化保實驗室提供，黃瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumsp. cucumebrium)由天津農學院植物病理實驗室提供。培養基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基：PDA、PDB。黃瓜(CucumissativusL.)品種為‘亮優D18’(天津億聯特科技發展有限公司)。藥劑：50%的多菌靈可濕性粉劑(江陰市農藥二廠有限公司)、10%苯醚甲環唑水分散粒劑(天津漢邦植物保護劑有限責任公司)。

1.2 種子液制備

從活化好的菌株HJG-5平板上打取2個菌餅(d=5 mm)，接種在100 mL PDB培養基中，于28 ℃、180 r/min振蕩培養3 d、5 d、7 d后得到不同種子培養液[17]，取100 μL涂布在PDA培養基上，測定其活菌數，挑選培養時間最優的種子液進行后續試驗。用無菌水將菌液活菌數調至約為106～107cfu/mL[18]。

1.3 菌株 HJG-5的固態發酵條件優化

固態發酵基質的篩選：選取大米粉、玉米粉和小米粉3種基質，分別稱取144 g不同基質放入500 mL燒杯中于121 ℃滅菌20 min，等量分裝成12小份置于50 mL的滅菌小燒杯中。固體發酵條件：接種量30%,初始含水量達到50%， pH=7，HJG-5種子液與每份固料充分混合，用封口膜封蓋，每隔12 h 搖晃1次，置28 ℃恒溫培養 7 d，30 ℃烘干后。采用平板菌落計數法，測定不同處理的菌落生長情況[18]，下同。每個處理設6次重復。

1.4 碳、氮源篩選

從“1.3”篩選出的最佳基質(大米粉，下同)，分別添加葡萄糖、可溶性淀粉、麥芽糖、蔗糖、紅糖、乳糖、玉米秸稈、紅薯粉和麥麩等碳源及胰蛋白胨、酵母粉、花生粉、黃豆粉、尿素、硫酸銨、硝酸鉀、氯化銨、綠豆粉和小米粉等氮源。以不加碳氮源的大米粉為對照。依照10∶1的質量比把基質和各種碳或氮源放置于燒杯中進行混合，121 ℃滅菌20 min，再加入3 mL HJG-5種子液混勻，采用“1.3”方法培養、烘干、稀釋、涂布、測定活菌數。設3次重復。

1.5 固態發酵條件優化

通過L16(45)正交表，測定初始pH值(7、 7.5、8、8.5)、接種量(1.0、0.8、0.6、0.4 mg/g)、培養時間(120、144、168、192 h)、碳源(麥芽糖200、150、100、50 mg/g)、氮源(胰蛋白胨100、75、50、25 mg/g)5因素4水平，采用“1.3”處理方法培養并測定固態發酵物的活菌數，設3次重復。

1.6 助劑篩選

將“1.5”中最佳發酵配方所得的固體發酵物在25 ℃鼓風機中干燥，研碎備用。將固態發酵物分別與12種助劑按質量比20∶1分別進行混合，不加助劑為對照。助劑包括：載體(硅藻土、殼聚糖、高嶺土、碳酸鈣)、分散劑(海藻酸鈉、腐植酸鈉、糊精、可溶性淀粉)、紫外保護劑(十二烷基硫酸鈉、吐溫-80、羧甲基纖維素鈉、聚四氟乙烯濃縮分散液)。添加載體和分散劑的處理在28 ℃培養箱室溫下靜置5 d，添加紫外保護劑的處理則在254 nm 紫外燈下距離 40 cm 處照射4 h，在 28 ℃培養箱室溫下靜置5 d。采用“1.3”方法測定添加助劑后的活菌數。設3次重復。

1.7 粉劑及顆粒劑的制備

參考“1.6”測定的結果，選取殼聚糖、糊精、聚四氟乙烯濃縮分散液3種助劑。采用L9(33)正交試驗測定3種助劑3個水平(100、50、20 mg/g)下的活菌數。3種助劑分別與HJG-5固態發酵物充分混勻，烘干后用小型粉碎機磨成菌粉，在28 ℃培養箱室溫下靜置5 d。采用“1.3”處理方法測定活菌數。3次重復。根據正交試驗結果選出的最優組合，按照其配方將固體發酵物與3種助劑混勻、烘干、磨碎后制成粉劑。

將10 mg/g的海藻酸鈉以及上述粉劑按質量比4∶3進行混合，再滴入0.028 g/mL的氯化鈣，成粒后瀝水，室溫中自然風干，制成顆粒劑。

1.8 菌劑對枯萎病的溫室防效

試驗地選擇在天津農學院小棗園。于2019-06-26進行黃瓜催芽試驗，3 d后選擇露白種子種植在花盆中(d=10 cm)。試驗共設5個處理。于7月7日將粉劑、顆粒劑采用拌土處理，分別與營養土混勻(質量比1∶100)；發酵種子液與營養土混勻(體積與質量比為1 mL∶50 g)；用50%的多菌靈可濕性粉劑稀釋500倍液和10%苯醚甲環唑水分散粒劑稀釋1 500倍液進行灌根。另設清水對照。于7月17日在幼苗的根莖基部用一次性注射器針頭輕微刺傷3處，采用灌根法，分別接種10 mL 1×108cfu/mL的枯萎病菌。每處理重復3次，每次重復為20株。接種7 d、14 d和28 d后，記錄植株發病情況。按沈萍等[18]方法劃分病情級數。病情指數=∑(病級×該病級株數)/(調查總株數×最高病級)×100；防治效果=(對照病情指數-處理病情指數)/對照病情指 數×100%。

1.9 數據分析

運用SPSS 17.0統計軟件對試驗數據進行分析，采用Duncan’s新復極差法做差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 菌株HJG-5種子液及固態發酵基質的篩選

不同培養時間下種子液中的活菌數呈極顯著差異(P<0.01)。培養7 d時種子液的活菌數最多，達1.263×107cfu/mL，明顯高于3 d (2.56×103cfu/mL)和5 d(7.18×104cfu/mL)種子液的活菌數。3種發酵基質對菌株HJG-5產孢量也存在極顯著差異(P<0.01)，活菌數分別為：大米粉1.665×108cfu/g，小米粉1.467×108cfu/g，玉米粉1.270×108cfu/g。可見，大米粉處理下的活菌數優于小米粉和玉米粉，后續試驗將菌株 HJG-5固態發酵基質選定為大米粉。

2.2 菌株HJG-5碳源和氮源的篩選

不同碳源和氮源均影響菌株 HJG-5的活菌數(表1)。麥芽糖為碳源時，其活菌數為 16.27×108cfu/g，顯著優于其他碳源，而蔗糖效果最差，活菌數只有5.8×108cfu/g，甚至低于對照。將麥芽糖選定為最終碳源；在有機氮源中，胰蛋白胨處理組的活菌數最多，達6.77×109cfu/g，顯著高于其他處理，將胰蛋白胨選定為最終氮源。

表1 不同碳源和氮源下菌株HJG-5的活菌數Table 1 Colony count of strain HJG-5 under different carbon and nitrogen sources

2.3 菌株HJG-5固態發酵條件的優化

菌株HJG-5固態發酵的正交統計結果如表2所示。在試驗的 5個不同因素中，根據直觀分析極差R值和F測驗結果可知：氮源(胰蛋白胨)(43.50)>初始pH(30.66)>碳源(麥芽糖) (25.84)>培養時間(24.00)>接種量(11.83)。氮源對活菌數的影響最大，而接種量值影響最小。5個因素主效應中，只有接種量的4個水平之間差異不顯著，其他4個因素差異均顯著。處理組合1和組合6的活菌數最大，但二者之間差異不顯著，組合6的活菌數極顯著高于其他處理組合，該組合為麥芽糖50 mg/g，胰蛋白胨50 mg/g，接種量0.8 mL/g，培養時間120 h，pH 7.5。直觀分析最佳發酵條件應為：麥芽糖50 mg/g，胰蛋白胨50 mg/g，接種量0.8 mL/g，培養時間120 h，pH 7.0。二者只有pH不同，分別為7.5與7.0，但差異不顯著。因此本試驗采用了組合6作為固態發酵條件。

表2 菌株HJG-5固態發酵的正交試驗結果 Table 2 Orthogonal test of solid-state fermentation of strain HJG-5

2.4 助劑的篩選及其優化配比

不同助劑對HJG-5原粉活菌數的影響如表3所示。不同的載體、保護劑、分散劑處理后均會改變原粉的活菌數。在載體中，高嶺土效果最佳，活菌數達1.66×1010cfu/g；保護劑中海藻酸鈉效果最佳，活菌數達1.67×1010cfu/g；分散劑中羧甲基纖維素鈉效果最佳，活菌數達1.35×1010cfu/g；而原粉對照活菌數為1.05×1010cfu/g(固態正交發酵組合6活菌數為12.10×109cfu/g)。3種助劑均能極顯著提高原粉的活菌數(P< 0.01)。選擇這3種助劑開展優化配比的正交 試驗。

HJG-5原粉助劑優化配比的正交統計結果如表4所示。根據直觀分析極差R值和F測驗結果可知：高嶺土(67.67)>羧甲基纖維素鈉 (21.78)>海藻酸鈉(14.33)，高嶺土(載體)對活菌數的影響最大，海藻酸鈉(保護劑)最小。直觀分析與多重比較結果一致，均以組合3為最佳配比，即高嶺土100 mg/g，羧甲基纖維素鈉20 mg/g，羧甲基纖維素鈉20 mg/g，HJG-5粉劑活菌數達到1.74×1010cfu/g。主效應中，高嶺土和羧甲基纖維素鈉的3個水平之間差異顯著，而海藻酸鈉的差異不顯著。采用組合3做為粉劑及顆粒劑制備的助劑配方。

表3 不同助劑下HJG-5原粉活菌數Table 3 Viable count of GSH-5 raw powder under different adjuvants

表4 助劑優化配比的正交試驗Table 4 Orthogonal test of optimum proportion of adjuvant

2.5 不同劑型對黃瓜枯萎病的防治效果

菌劑對黃瓜枯萎病的防治效果如表5所示。7 d時，HJG-5發酵液、粉劑、顆粒劑防效均超過60%，均高于多菌靈的58.62%。其中粉劑效果最佳，達68.97%，顯著高于多菌靈的(P<0.05)，但三者防效又均顯著低于苯醚甲環唑的(P< 0.05)。14 d時，發酵液的防效下降較明顯，粉劑和顆粒劑的防效仍保持在60%以上，顯著高于發酵液和多菌靈的(P<0.05)，但仍顯著低于苯醚甲環唑的(P<0.05)。28 d時，HJG-5發酵液、粉劑、顆粒劑防效均有所下降，但仍高于多菌靈的，且顆粒劑顯著高于發酵液的(P<0.05)。在28 d的防治期內，苯醚甲環唑的防效一直在80%以上，而生防菌劑的防效均高于多菌靈的，且總體上粉劑與顆粒劑的防效又高于發酵液的。

3 討 論

生防菌的菌體存活力是決定其最終防效的因素之一。菌株在培養中所涉及到的營養成分、培養條件決定了菌株產生活性物質的種類和產量[12]。本試驗確定了菌株HJG-5的最佳固體發酵基質為大米粉，這與冀媛媛等[11]對放線菌 SC1-1菌劑研制中所得結果一致。大米粉有利于發酵基質的松散，便于菌體的呼吸，且成本較低，是許多菌株發酵所選的重要基質。但不同的放線菌對淀粉性基質的選擇具有多樣化，如王婷婷等[8]認為放線菌WZ60最優基質是黃豆粉；梁春浩等[12]認為放線菌PY-1最優基質是玉米粉；王彥等[19]認為放線菌16-3-10最優基質是小米粉。總之，優化培養基和培養條件可獲得最佳的生產效率和經濟效益。

表5 HJG-5不同制劑對枯萎病的田間防效Table 5 Field control effect of different agents of HJG-5 against Fusarium wilt

在實際生產過程中，除發酵條件外仍有眾多因素影響影響生防菌劑的效果，選擇適合的載體和助劑是衡量生物農藥最佳配方的首要因素[15]。助劑不僅可以增加生物菌劑的活性或保存期，而且可以加強宿主植物機體的抵抗能力，提高體內某些酶的活性，也能夠幫助宿主植物吸收氮、磷、鉀等元素，提高其對環境的適應能力[20]。在本研究的助劑正交試驗中，HJG-5粉劑的活菌數超過1.74×1010cfu/g，即活菌數每克超過100億。這與冀媛媛等[11]對放線菌SC1-1粉劑助劑的篩選研究其活菌數量達到1.72×1010cfu/g的結果 相近。

菌株HJG-5對黃瓜枯萎病的防效均高于常見藥劑多菌靈，但又顯著低于新型藥劑苯醚甲環唑。從HJG-5不同劑型的防效上看，發酵液是低于制劑的，可能是其原本活菌數較低的緣故。粉劑早期效果好于顆粒劑，但后期顆粒劑效果更好，這與劑型的物理化學性質及穩定性密切相關。將生防菌制備成顆粒劑后，由于其形態較為固定，可以緩慢釋放，持效期長，甚至雨水能夠充當其與土壤以及寄主生物相融合反應的媒介[15,21]。粉劑與土壤的表面接觸面積更大，但是其因釋放過快，效果不能持久，反而會減緩防病效果。因此，顆粒劑作為一個緩慢釋放生物拮抗菌的劑型，盡管其在初期的效果可能不如粉劑與發酵液，但由于其持效期長，對所含生防菌的利用度高，且不低于常規藥劑的防效，因而更適宜用于植物土傳病害的防治，目前顆粒劑已成為代表省力化劑型開發的新熱點[22-23]。在田間使用菌株HJG-5粉劑和顆粒劑時，建議間隔期不超過14 d，應重復使用，在田間會有更突出和更持久的效果。