13CO2示蹤不同化學形態氮素添加對高寒草甸植物光合碳分配的影響

宋明華,陳 錦,蔣 婧,王 楓,于飛海

1 中國科學院地理科學與資源研究所生態系統網絡觀測與模擬重點實驗室, 北京 100101 2 中國科學院大學, 北京 100049 3 江蘇丘陵地區南京農業科學研究所, 南京 210046 4 內蒙古赤峰市產品質量計量檢測所,赤峰 024005 5 臺州學院浙江省植物進化生態學與保護重點實驗室, 臺州 318000

青藏高原的高寒草地大部分由嵩草類植物占據優勢,這類植物地上呈密集的叢生型,蓋度很高,而地下發育著密集的根系,往往形成致密的草氈層[1]。嵩草草地范圍從海拔3000 m至5900 m均有分布[1],覆蓋面積約為421591 km2[2],占整個高原面積約三分之一,儲藏著大量的土壤有機碳。如此大的碳儲量源于植物將大量的光合作用固定的碳輸入到土壤[3],同時較長的旱季和冷季也使固持的有機碳較長時間滯留于土壤中,周轉緩慢[4]。當土壤碳截存的狀態受到環境變化的干擾時,土壤中的碳就會被快速和大量地釋放到大氣中。土壤碳庫的微小變化將會引起大氣中二氧化碳的劇烈變化[5]。

由于低溫和土壤養分(尤其是低有效氮(N))的限制,高寒草甸生態系統的初級生產力很低[4]。施肥(N肥等)成為改善青藏高原的飼草質量、提高地上生產力的經營方式之一[6- 7]。此外,根據IPCC(2010)的報告,全球大氣氮沉降增加的同時,青藏高原的氮沉降量也逐漸增加。肥料(N肥)的使用和大氣氮沉降的增加等引起土壤有效氮的增加,而土壤有效氮素的提高會引起植物群落物種組成的改變,如禾草類植物增加,逐漸取代嵩草類植物的優勢地位,而禾本科植物對植物群落生物量有較大的貢獻[8]；禾草與雜草類植物在群落中的比例也發生了變化,物種豐富度會隨著生產力的增加而降低。另外,增加氮輸入會引起植物光合碳(C)的增加,也會改變植物向地下輸入的C量,進而通過根系分泌物、根際碎屑等活性碳激發土壤原有有機質的分解。氮輸入會引起植物群落結構上的改變,植物群落的這些變化最終會影響植物光合碳在地上和地下碳庫中的分配,進而影響土壤碳庫動態與截存。此外,氮的長期輸入還會引起土壤微生物組成及類群的變化,這些變化會直接影響微生物的活性進而影響有機質的分解。

除了氮素輸入劑量對光合碳分配及土壤碳動態的影響外,氮素輸入的化學形態也會通過對植物群落和土壤微生物組成的影響進而作用于碳動態的變化。已有研究表明輸入低劑量N能夠增加植物凋落物的輸入,進而提高N匱乏的生態系統的碳固持量[9- 11]。同時,高劑量N輸入引起莎草草甸[12]、泥沼[13]和一年生草地[14]的碳排放量的增加。目前,關于不同形態氮素的長期添加對草地植物的光合C在植物-土壤系統各碳庫中的分配以及動態變化的影響的研究較少。一般而言,群落中的優勢物種會優先利用土壤中含量較高的化學形態的氮素[15]。盡管不同植物物種對不同形態氮素利用存在偏好,但是植物對不同化學形態的氮素吸收利用具有一定的可塑性[16]。因此,不同化學形態的氮素輸入可能會引起群落內不同養分利用方式的植物的響應方式不同,進而引起群落結構的變化。因此探尋草地生態系統地上、地下生態過程對不同形態氮素添加的敏感性,闡明不同形態氮素的長期添加對草地光合C動態的影響和作用機制,能夠為制定草地科學合理的經營管理方式,實現資源可持續利用提供理論依據。

基于青藏高原海北高寒草甸生態系統研究站已經開展10年的不同化學形態氮素長期輸入的實驗,利用13CO2示蹤技術,量化氮素添加處理下光合碳在植物地上組織、地下根及土壤中的分配,以及土壤呼吸中釋放的CO2。回答以下科學問題：(1)不同形態不同劑量N輸入引起高寒草甸土壤C儲量的變化如何？(2)長期N輸入引起光合碳在植物組織、土壤中分配量的變化如何？(3)植物光合碳分配模式與土壤呼吸釋放CO2-C的關系如何？

1 研究地概況

研究地位于中國科學院海北高寒草甸生態系統定位研究站(簡稱海北站,37°37′ N,101°19′ E,海拔3200 m)。該站位于青藏高原東北隅,祁連山北支冷龍嶺東段南麓的大通河谷。氣候是高原大陸性季風氣候,僅有冷、暖兩季之分,年平均氣溫-1.7℃,夏季溫暖多雨,冬季寒冷干燥,7月平均氣溫9.8℃,1月平均氣溫-14.8℃。年均降水量約580 mm,植物生長季(5—9月)集中了全年降水的80%[17]。

研究區域的優勢物種為矮嵩草(KobresiahumilisSerg)和異針茅(StipaalienaKeng)、垂穗披堿草(ElymusnutansGriseb)。植被覆蓋率超過95%[18]。該地區土壤為高山草甸土、高山灌叢草甸土和沼澤土[19]。該地區土壤有機質和全量養分豐富,但速效養分很低 (表1)。 高寒草甸土壤總氮含量較高,但有效氮含量匱乏[20]。因其降水量80%分布于植物生長季的5—9月,所以在6—8月間,土壤水分含量較高,能保證植物的生長需求。

2 研究方法

2.1 樣地布設和實驗設計

自2005年,在青海海北站選取60 m × 80 m大小的一片均勻一致的草地作為實驗樣地,此樣地自設置起用圍欄圍封,不存在大型家畜,如牦牛、羊等的采食。該實驗采用完全隨機化區組設計,設置3個裂區,每個裂區10個樣方,樣方大小為2 m × 2 m,共30個。任何相鄰兩個樣方間隔1 m。樣方內植被與樣方外植被的分割采用高為30cm的鐵皮沿樣方四周打入地下25cm,地上部分保留5cm。添加的氮素化學形態是：銨態氮(Am)、硝態氮(Ni)、NH4NO3(AN),氮素添加劑量是低(L,0.375 g N m-2a-1)、中(M,1.5 g N m-2a-1)、高(H,7.5 g N m-2a-1)3個氮濃度的正交實驗,共9個處理,記作AmL,AmM, AmH, NiL, NiM, NiH, ANL, ANM, ANH,另設置一個對照CK。每種處理3個重復。每年7月初和8月初各施肥一次,每次施肥量是總劑量的1/2。將相應劑量氮化合物溶于5 L水中,用噴壺均勻灑于對應的樣方內,對照只灑5 L水。3種形態氮素所對應的化合物試劑分別為(NH4)2SO4, NaNO3和NH4NO3。

該實驗基于上述長期氮素添加實驗。實驗開展后第6年的研究結果表明,低、中劑量的氮素添加沒有引起群落物種組成和地上生物量的顯著變化[18],而高劑量氮添加處理下植物群落地上生物量和土壤微生物量氮及土壤理化性質發生了顯著變化(表1)。考慮到試驗費用和操作時間上的可行,該實驗僅選取其中3種氮形態的高濃度和對照4種處理開展13C-CO2的標記實驗,即AmH, NiH, ANH, CK。總共12個樣方。實驗于2014年8月1日開始,于8月31日結束。

表1 不同化學形態氮素長期輸入對土壤理化性質的影響

2.2 13C脈沖示蹤實驗

實驗于8月1日至8月31日期間進行,在高氮處理及對照每個2 m×2 m的樣方內選取兩個40 cm×40 cm的小樣方,其中一個用于13C示蹤實驗,另一個為對照樣地。用于對照處理的小樣方其4個角用木棍做好標記；用于示蹤的小樣方沿著小樣方的四個邊外側挖開至2 cm深左右,將立體金屬架安置在槽內,金屬架大小為40 cm×40 cm×30 cm(長、寬、高)；在實驗開始的前一天下午,將塑料薄膜包裹在立體架外面,并將底部沿4個邊埋入槽內,用濕土把薄膜蓋好,避免漏氣。箱壁插入地面5 cm深,并用孔徑為45 μm的尼龍網裹住,尼龍網延伸至地面下10 cm深,以便隔斷來自標記箱外的植物根系,而養分和水分可以相互交換。箱的內表面抹上防霧劑來降低標記過程中水蒸汽濃度,從而增加光強和降低13CO2溶解在箱內表面水滴中的量。標記選在晴朗的天氣中午10：00,CO2(99 at%13C)被儲藏在高壓瓶內,通過降壓閥和直徑4 mm的進氣管輸入箱內,流速為0.125 L/min,并用流量計測量流量。密閉箱上部側面安裝了兩個風扇,用于降低內部溫度。為了消除CO2濃度對植物光合過程的影響,需將實驗中的CO2濃度控制在大氣CO2濃度或者略高于大氣中的CO2濃度范圍內。13CO2輸入1 h后停止,箱保持密閉狀態再持續5 h[21]。氣體輸入流量和標記時間根據以往觀測的光合速率和地下生產力來確定,確保植物地上莖、葉和地下根系樣品有足夠高的13C豐度[22]。

2.3 植物組織取樣

在標記后第1,6,14,21,30天,氣體取樣同時收獲植物樣品,將植物地上部分貼地面剪下,僅綠色莖和葉用于13C分析。植物取樣時將植物地上莖和葉混勻后隨機取樣,代表整個群落水平的物種組成。植物根系在采集土壤樣品同時采集,根系放在孔徑為0.5 mm的篩子內仔細清洗,去除吸附的土壤和暗棕色/黑色碎屑物質。莖、葉和根樣品在70℃下48h烘干,用于測量植物生物量、植物樣品中13C、C含量指標。

2.4 土壤呼吸取樣

預計在示蹤后第1,6,12,24小時和第4、7,15和30天收集土壤呼吸釋放CO2。在13C示蹤后的實際取樣過程中,第1,6,12,24小時進行了呼吸取樣,而13C示蹤后的第4天下雨,為了減少降雨的干擾,我們將取樣時間推遲到第6天,隨后的取樣時間大體按照14、21、30d進行,推后的時間也控制在1d之內。由于根系取樣是在第1,6,14,21,30天,所以土壤呼吸樣品13C的測定也抽取相應時間點上的樣品進行了分析。樣品收集采用2種不同型號的透明PVC箱,大箱高15 cm直徑20 cm,用于收集植物-土壤系統呼吸釋放的CO2。這些箱內植被地上部分保留,用于測定生態系統呼吸。小箱的高為25 cm直徑5 cm,這些箱放置的位置植被地上部分被收獲,用于測定植物根與微生物呼吸。每個箱的頂部有一個用橡皮塞密封的孔用于針頭取樣。每個箱內抽取70 mL氣體立即注射進鋁-塑料組合的氣袋內(TPV-005,Dalian Delin Gas Packing Co.,Ltd.,Dalian,China)用于分析呼吸釋放CO2-13C。每一次取樣同時在距地面2 m高用注射器取大氣樣品作為13C的對照測定。

2.5 土壤樣品取樣

在標記后的第1,6,14,21,30天,用直徑5 cm、深度20 cm的土鉆在每個樣方內的2個小樣方取6份土,將同一樣地收集的土壤樣本混合成一個復合樣本,并通過一個2mm的篩子將根系和粗石清除后,篩選出的土壤放入在4℃保存,并將其轉移到實驗室用于后續的測量,風干后分析總C和13C。此外,用環刀在每個樣方內取得土壤樣品,測得土壤容重指標。

2.6 植物和土壤樣品的有機碳、氮含量及其 δ13C的測定值

其分析的基本原理和測定過程是:樣品經高溫燃燒后(氧化 /還原爐溫度為 950℃),通過 TCD (Thermal Conductivity Detector)檢測器測定有機碳、氮含量,剩余氣體進入 ConFlo IV 導入穩定同位素質譜儀,在質譜儀上測定 δ13C值(Delta Plus, Thermo Fisher Scientific, Bremen, Germany)。在計算時,將剛剛標記完的莖和葉內13C的量視為標記過程中植物固定的全部13C,樣品中13C的回收率為其他時間點的樣品中13C的值除以剛標記完的植物莖和葉內13C的量。植株(根系和地上部)和土壤中13C含量的計算如下:

13C樣品=[(At13C%) L- (At13C%) uL]×TC×100

式中,13C樣品表示樣品中13C含量,At13C% 表示樣品中含13C的豐度; L 和 uL 分別表示標記和非標記; TC 樣品表示樣品中總有機碳的含量。

2.7 植物、土壤C濃度,土壤容重

用于C濃度分析的土壤子樣品風干后,過2mm篩,然后在球磨機中研磨。采用改良的Walkley-Black法,在175℃下煮沸土壤-硫酸混合物5min[23- 24]。采用1.1逆變換因子對Walkley-Black方法獲得的SOC測量結果進行校正[23],修正了含水率和干重對有機物含量的影響。對植物樣品烘干稱重后,利用連續流動同位素質譜儀(EA 1110; CE Instruments, Milan, Italy) (EA-IRMS)和連接到IRMS的ConFlo II設備(FinniganMAT 253, Bremen,Germany)進行分析。土壤水分的重量測量。用已知體積的土壤環刀測定土壤容重。

2.8 C儲量的測定值

植物C儲量公式如下：

Cpool=B樣品×C樣品%

式中,Cpool(kg/m2)為植物樣品的C庫,B樣品(kg/m2)為植物樣品干重質量,C樣品%(%)為樣品C含量。

土壤碳儲量[25- 26]公式如下：

SOC=Cs×D×E×(1-G)/10

式中,SOC(kg/m2)為土壤有機碳密度,Cs、D、E、G分別為土壤有機C含量(%),土壤容重(g/cm3),土壤層厚度(cm)和大于 2 mm 的石礫所占的體積百分比(%)。

2.9 數據分析與統計

采用Oneway-ANOVA(單因素方差)分析方法,多重比較采用 Tukey 法,分析了氮素添加處理下植物地上生物量、地下生物量、土壤碳庫和土壤呼吸速率的差異,檢驗了氮素添加處理對光合碳在莖和葉、根、土壤以及土壤呼吸中分配的比例及隨時間變化動態。利用回歸分析擬合了光合碳在土壤呼吸釋放CO2中隨時間衰減的關系。數據統計分析采用 SPSS 16。

3 結果

3.1 不同化學形態氮素長期添加對植物地上、地下生物量,土壤碳庫及根碳比例的影響

外源氮素添加10年后,氨態氮處理下的地上生物量高于對照處理下的地上生物量的值的49.5%,其他處理之間地上生物量的值沒有顯著差異(圖 1)。與對照相比,氨態氮處理下的地下生物量的值增加了111.3%,并且氨態氮處理下的地下生物量也顯著高于硝態氮和硝酸氨處理下的值,而對照、硝態氮和硝酸氨3個處理之間沒有顯著差異。同時,氨態氮處理下的土壤碳儲量顯著高于硝態氮處理下的值(P=0.007),而其他處理之間無顯著性差異。氨態氮處理下根碳比例顯著高于對照和硝態氮及硝酸銨處理下的值(P=0.002)。

圖1 不同化學形態氮素長期輸入對土壤-植物系統的不同碳庫的影響Fig.1 Effects of long-term N addition in different chemical forms on on different carbon pools in soil-plant systemsCK, 代表不加N處理； Am, 代表7.5 g N m-2 a-1劑量添加的NH4-N的處理;Ni,代表7.5 g N m-2 a-1劑量添加的NO3-N的處理；AN,代表7.5 g N m-2 a-1劑量添加的NH4NO3-N的處理;相同小寫字母表示處理間差異不顯著

3.2 不同化學形態氮素長期添加對光合碳在植物地上莖和葉和地下根中分配比例的影響

13C同位素標記后1天測定植物莖和葉內的13C占剛剛標定完莖和葉內13C的80%左右,不同處理之間沒有顯著性差異。隨著植物不斷固定光合碳輸入的稀釋以及13C向地下組織的分配,莖和葉內13C隨時間呈現下降的趨勢,到標定后的第30天,莖和葉內13C的滯留量約占初始量的30%左右(圖 2)。而且,硝態氮處理下的值到第21和30天顯著低于對照和氨態氮處理下的值,表明硝態氮處理下,植物光合固定的碳在短期內迅速輸入地下組織和土壤中(P<0.05; 圖 2)。相反,根系中13C的量隨時間呈現緩慢增加的趨勢,從標記后第1天的10%增加到30天的22%左右。而且,標記完的14天至第30天期間氨態氮處理下的根系組織中滯留13C的量顯著高于硝態氮處理下的量(P<0.05; 圖 2)。

圖2 13C示蹤的不同化學形態氮素長期輸入對植物光合碳在地上莖和葉、地下根中分配比例的影響Fig.2 13C tracing photosynthetic carbon dynamics in shoot and root of plant species during the chase period in the 10th year of the N fertilization experiment

3.3 不同化學形態氮素長期添加對土壤呼吸釋放CO2速率的影響,以及對光合碳在土壤呼吸釋放CO2中動態的影響

土壤中滯留的13C整體呈下降趨勢,相對其他處理,硝態氮處理下的土壤中13C下降速率較快,而且至標記后30天,硝態氮處理下的土壤中13C滯留量最低(圖 3)。實驗觀測的30天期間,土壤呼吸速率隨時間呈增加趨勢。硝態氮處理下的土壤自第14天起呼吸速率增長幅度最快,顯著高于其他三種處理(P<0.05; 圖 3)。而氨態氮處理下的土壤自第21天起呼吸速率顯著低于其他三種處理下的值(P<0.01; 圖 3)。從土壤呼吸中13C的動態上看,不同處理下的土壤呼吸中13C的滯留量隨時間呈指數衰減的變化趨勢(圖 4)。其中硝態氮處理下的13C隨土壤呼吸釋放出CO2量衰減最快(圖 4)。

圖3 13C示蹤的不同化學形態氮素長期輸入對光合碳分配到土壤中的比例以及對土壤呼吸釋放CO2速率的影響Fig.3 13C tracing photosynthetic carbon dynamics in soil during the chase period and the effect of addition of N

圖4 13C示蹤的不同化學形態氮素長期輸入對光合碳分配在土壤呼吸釋放出的CO2中的動態變化Fig.4 13C tracing photosynthetic carbon dynamics in soil 13CO2-C efflux rate during the chase period in the 10th year N fertilization experiment

4 討論

4.1 植物光合碳在地上和地下組織中的分配對不同化學形態氮素輸入的響應

我們的結果發現與對照處理相比,氨態氮添加處理下的地上生物量增加了49.5%,氨態氮處理下的地下生物量的值增加了111.3%。這是因為在高寒草地生態系統,植物的生長受N素限制。添加N肥之后,N素受限解除,植物生長加快,植物的生物量增加。張林海等[27]認為植物光合固定的大部分C保留在地上部分。此外,在我們之前的研究中發現,長期添加不同形態N肥,氨態氮處理下的禾本科植物物種豐富度和生物量都會增加,而在植物群落中,禾本科植物對群落水平的生物量有較大的貢獻,地上生物量也會相應增加[28]。同時,植物也會將較多的光合產物分配到地下,從而增加地下生物量。另外,許多研究表明不同植物物種對不同形態氮素的利用存在一定的偏好差異[29- 30]。在養分(如N)受限的土壤中,為了促進植物群落中不同物種共存,植物物種之間會存在生態位互補[16,31,32]。一般情況下,莎草科和豆科植物更加偏好利益氨態氮,雜草植物更喜歡偏好利用硝態氮[32]。與氨態氮相比,有些植物更偏好吸收硝態氮的部分原因是硝態氮在土壤溶液中移動的速度更快,植物能更加快速的吸收利用[30,33]。因此,即使在長期添加N肥之后,植物物種豐富度和地上生物量都發生了改變[28],在群落水平上,植物地上生物量對不同N形態的響應不大。

4.2 不同化學形態氮素輸入對植物光合碳在土壤和土壤呼吸中的分配的影響

在研究中,我們發現氨態氮處理下的土壤碳庫顯著高于硝態氮處理下的值。不同處理下的土壤呼吸中13C的滯留量隨時間呈指數衰減的方式變化,其中,硝態氮處理下的13C衰減最快(圖 4)。土壤碳庫主要的來源是植物凋落物殘體和根系的死亡。在氨態氮處理下,地上、地下生物量都顯著高于對照處理,而其他處理之間沒有顯著的差異,這與土壤碳庫(圖1)的結果一致。植物固定的光合碳以根滲出物和分泌物等方式輸入到土壤中,根滲出物和分泌物主要是活性C物質,如非結構碳水化合物,淀粉,糖類和小分子酚醛等[34]。這些物質的輸入會改善微生物活性受土壤中活性C限制的強度,從而提高微生物活性。而微生物的活動直接調節著植物根際激發效應的強弱和方向。在N受限的生態系統中,微生物通過增加胞外酶的分泌來分解土壤中的有機質,從而釋放營養元素(如：N),產生正的激發效應。而在N充足的生態系統中,微生物會偏好利用易于分解的小分子有機物(如：根系分泌物),從而產生負的激發效應[35]。微生物中采取r策略的類群(如：細菌),更傾向利用易于分解的有機物(如：根分泌物)；而采取K策略的微生物類群(如：真菌),則是緩慢利用難以分解的土壤有機質[36]。氮素的長期輸入會顯著降低真菌和菌根真菌的數量,從而,可能會降低對惰性C組分有機質的分解。有研究發現,氮肥可誘導有機碳的負激發過程[37]。另外氨態氮的長期添加會顯著改變土壤理化性質(如：土壤pH的降低、土壤團聚體結構等的變化表1),土壤性質的改變也會引起土壤微生物組成和活性的變化[25]。這些變化最終導致氨態氮處理下土壤呈現負的激發效應,而硝態氮處理下土壤呈現正的激發效應[29]。這些結果與本研究中觀測到的氨態氮和硝態氮下土壤呼吸以及光合碳在呼吸中的分配結果相一致。

4.3 植物光合碳模式對不同化學形態氮素輸入引起的植物與土壤碳庫變化的作用機制

植物通過光合作用固定大氣中的CO2,而在不同環境下,植物對光合產物分配的模式也不一樣。不同化學形態氮素的長期輸入引起的植物變化的作用機制是,在植物群落水平上,不同功能群的植物對不同形態N素有不同的偏好,功能群之間的相互補償性也使得不同化學形態N素輸入下,地上生物量具有一定的穩定性。研究結果表明,氨態氮處理下的土壤碳儲量顯著高于硝態氮處理下的值,而其他處理之間無顯著性差異(圖 1)。不同化學形態氮素的長期輸入引起的土壤碳庫變化的可能的作用機制是,不同化學形態氮素的長期輸入引起了植物種類發生改變,進而引起土壤微生物組成的變化,而不同類型的微生物對土壤有機質的影響是不同的。同時,植物根系分泌物進入到土壤中,提高微生物的活性,微生物分泌胞外酶加快土壤有機質的分解[35]。氮肥可能提高了植物光合碳在土壤中的周轉率,但沒有改變水稻系統有機碳的絕對含量[38]。由于植物根系的分泌物多少的改變以及長期N素的輸入下土壤理化性質和土壤微生物類群的改變(表 1),最終引起土壤有機碳貯存的改變。

5 結論

基于在青藏高原矮嵩草草甸開展的不同化學形態氮素添加的長期實驗,利用13C示蹤方法揭示了光合碳在植物地上、地下組織的分配,及其隨時間在土壤中的滯留和隨土壤呼吸的釋放。實驗結論回答了我們提出的科學問題,研究結果表明不同化學形態氮素的長期輸入引起光合碳在植物地上、地下組織分配的差異,并且不同化學形態氮素處理下的土壤中光合碳的滯留以及光合碳隨土壤呼吸釋放的速率也存在顯著差異。總體上,硝態氮與氨態氮處理下光合碳分配存在顯著的差異,相比于氨態氮處理,硝態氮處理下光合碳在各個庫之間的轉移速率較快,最終通過土壤呼吸釋放的速率也最快。在全球變化(N沉降增加)的情況下,高寒草地的地上生物量會增加。在養分(如N)受限的土壤中,植物地上生物量在群落水平上對不同N形態的響應不大。而在氨態氮處理下的土壤碳庫顯著高于硝態氮處理下的值,因此,在對青藏高原高寒草地施肥時,選擇氨態氮比選擇硝態氮更利于土壤中碳的固持。