基于Caco-2細胞單層模型對鹽酸氨溴索吸收機制的研究

梁秋玲朱葉萌麥子盈王鳳姬龍淑嫻王 弋饒子亮鄺少松

(廣東省醫學實驗動物中心,廣東佛山 528248)

AMB是鹽酸溴己新的N-去甲基代謝物,是鹽酸溴己新在環己基環上去掉一個甲基再引入一個羥基的衍生物,這種結構的改變使AMB具有促進排痰、溶解粘液、緩解排痰性咳嗽、抗炎、抗氧化和局部麻醉的作用[1]。根據世界衛生組織發布的解剖治療化學分類系統,自1970年以來AMB廣泛用于伴有痰液分泌不正常及排痰功能不良的急性、慢性呼吸系統疾病[2]。除此之外,近些年來AMB的應用領域越來越廣,例如改善帕金森病癥狀,提高肌萎縮性脊髓側索硬化癥大鼠模型的運動機能和存活率,抑制肥胖大鼠模型的術后腹腔粘連[3-5]。AMB還可通過聯合給藥治療方案治療肺癌,帕金森病、中耳炎、延緩耐藥性等[6-9]。盡管AMB已經廣泛應用于臨床治療,但是AMB仍然存在一定的胃部灼燒、惡心、嘔吐、致敏等副作用,歐盟的藥物警戒風險評估委員會(PRAC)于2015年專門發表了一篇關于AMB應用安全性的文章,里面就提到AMB存在過敏反應的副作用[2]。研究AMB的吸收機制從而提高其生物利用度可減少不良反應的發生,但是很少有文章研究AMB的吸收機制。

Caco-2來源于人結腸腺癌細胞,可在培養過程中進行腸細胞分化,Caco-2細胞接種到碳酸聚脂多孔膜等基質上,在培養21 d后可自發形成有極性的,具微絨毛以及緊密連接等類似于小腸上皮細胞刷狀緣側的分化特征的單細胞層[10-11]。因此,Caco-2細胞可以模擬小腸上皮細胞,廣泛用于藥物吸收過程中物理和生化屏障的研究[12]。Caco-2細胞單層模型廣泛應用于藥物在小腸吸收的評價和轉運機制研究中,Caco-2細胞的結構和功能類似于人小腸上皮細胞,表達與小腸刷狀邊緣上皮相關的外排轉運體,例如P-糖蛋白(P-gp)和乳腺癌耐藥蛋白(BCRP2)[13-14]。盡管人腸上皮由多種不同類型的細胞組成,但主要成分還是小腸上皮細胞,并且小腸上皮細胞是形致密的細胞單層和表達各種外排轉運體的重要組成部分,因此Caco-2細胞單層模型可用于模擬腸道吸收的藥物篩選模型[15]。

本文通過Caco-2細胞單層模型研究AMB在腸道中的吸收機制,探索影響AMB吸收的關鍵因素,提高其生物利用度。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

人結直腸腺癌細胞Caco-2,購于中國科學院干細胞庫。

1.2 主要試劑與儀器

AMB,批號100599-201604、METO,批號100084-201403、阿昔洛韋,批號140630-201403,均購自中國食品藥品檢定研究院;羅丹明 123,批號041818180905,購自碧云天生物技術有限公司;MEM基礎培養液,批號8119027,GIBCO;胎牛血清(fetal bovine serum,FBS),批號：FBS00717-1,AUSGENEX;100X非必需氨基酸溶液,批號8820010101,GENVIEW;100 mmol/L丙酮酸鈉溶液,批號2003977,GIBCO。24孔Transwell培養板,批號26217029,Corning;1260高效液相色譜儀,安捷倫科技(中國)有限公司;Millicell ERS-2細胞電阻儀,德國Meck millipore。

1.3 實驗方法

1.3.1 Caco-2細胞單層模型的建立

用含10%FBS、1%雙抗、1%非必需氨基酸、1 mM丙酮酸鈉的MEM完全培養液培養Caco-2細胞,當細胞生長至70%～80%匯合時,消化細胞,調節細胞密度至每毫升 2×105個,接種于 24孔Transwell培養板中,頂端(AP)加入0.1 mL細胞懸液,底端(BL)加入MEM完全培養液0.6 mL,置37℃、5%CO2培養箱中培養,隔天換一次液,培養7 d后每天換液,連續培養至21 d。

1.3.2 HPLC檢測

AMB和METO檢測的色譜條件用ZORBAX SBC18(150 mm×4.6 mm,5μm)色譜柱,以磷酸氫二銨-乙腈混合溶液(用磷酸調節pH至7.0)-乙腈(50∶50)為流動相,流速為 1.0 mL/min,柱溫25℃,AMB的檢測波長為248 nm,METO的檢測波長為275 nm。阿昔洛韋檢測的色譜條件用ZORBAX SB-C18(150 mm×4.6 mm,5μm)色譜柱,以甲醇-水(10∶90)為流動相,流速為1.0 mL/min,柱溫35℃,檢測波長為254 nm。

1.3.3 Caco-2細胞單層模型完整性及功能性檢測

Caco-2細胞培養至第21天時,將細胞電阻儀的檢測電極用70%乙醇滅菌,HBSS沖洗電極晾干。用37℃預熱的HBSS輕柔地清洗細胞單層,將細胞電阻儀的檢測電極置于Transwell小室內外側檢測電阻值并按公式(1)計算TEER,本文所有實驗均選用TEER≥200Ω·cm2的孔進行實驗,將Caco-2單層細胞用37℃預熱的HBSS洗滌平衡20 min后,于24孔Transwell培養板的AP端分別加入0.1 mL 50 μg/mL阿昔洛韋(pH 7.4)、20μmol/L羅丹明123溶液(pH 7.4),BL端加入0.6 mL HBSS(pH 7.4)進行AP→BL方向的轉運實驗。于BL端分別加入0.6 mL 50μg/mL阿昔洛韋(pH 7.4)、20μmol/L羅丹明123溶液(pH 7.4),AP端加入0.1 mL HBSS(pH 7.4)進行BL→AP方向的轉運實驗,于CO2培養箱中孵育2 h后從接收池取出阿昔洛韋檢測液進行HPLC檢測按公式(2)、(3)計算Papp和ER,羅丹明123檢測液用熒光酶標儀于507 nm激發波長,529 nm發射波長處檢測待測液熒光強度,同時檢測0、5、10、20、40 μmol/L 羅丹明 123 溶液的熒光強度繪制標準曲線再次檢測TEER值。

注：V：接收池的體積(單位：cm3);Ci：供給池的配制液濃度(單位：μg/mL);Cf：接收池的檢測液濃度(單位：μg/mL);T：培養時間(單位：s);A：24孔Transwell培養板小室底面積為0.33 cm2。

1.3.4 濃度對AMB Papp和ER的影響

將每毫升1.2×105個的Caco-2細胞懸液接種于96孔板中,孵育24 h后,分別加入MEM完全培養液作為陰性對照組,200μg/mL、100μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL、12.5 μg/mL、6.25 μg/mL AMB溶液與細胞共同孵育2 h后采用MTT法檢測細胞的存活率,選擇細胞存活率≥90%的AMB濃度做為AMB高劑量組,采用等比稀釋法設計AMB低、中劑量組。Caco-2細胞單層用預熱的HBSS洗滌平衡后,AP端加入15μg/mL METO(pH 7.4)作為高滲透性對照、分別加入0.1 mL AMB低、中、高劑量組溶液(pH 7.4),BL端加入0.6 mL HBSS(pH 7.4)進行AP→BL方向的轉運實驗。AP端加入0.1 mL HBSS(pH 7.4),BL端分別加入0.6 mL 15μg/mL METO(pH 7.4)、AMB低、中、高劑量組溶液(pH 7.4)進行BL→AP方向的轉運實驗,孵育2 h后從接收池中取出檢測液用HPLC法檢測METO、AMB的濃度,取樣結束后,再次檢測TEER值,確認實驗結束后Caco-2細胞單層的完整性。

1.3.5 藥物相互作用對AMB Papp和ER的影響

Caco-2細胞單層用預熱的HBSS洗滌平衡后,AP端分別加入0.1 mL AMB單獨給藥組溶液(pH 7.4)、METO單獨給藥組溶液(pH 7.4)、AMB和METO聯合給藥組溶液(pH 7.4),BL端加入0.6 mL HBSS(pH 7.4)進行AP→BL方向的轉運實驗。AP端加入0.1 mL HBSS(pH 7.4),BL端分別加入0.6 mL AMB單獨給藥組溶液(pH 7.4)、METO單獨給藥組溶液(pH 7.4)、AMB和 METO聯合給藥組溶液(pH 7.4)進行BL→AP方向的轉運實驗,孵育2 h后從接收池中取出檢測液用HPLC法檢測AMB、METO濃度,取樣結束后,再次檢測TEER值,確認實驗結束后Caco-2細胞單層的完整性。

1.3.6 pH對AMB Papp和ER的影響

Caco-2單層細胞用預熱的HBSS洗滌平衡后,AP端分別加0.1 mL AMB低、中、高pH組溶液,BL端加0.6 mL HBSS(pH 7.4)進行AP→BL方向轉運實驗,孵育2 h后從接收池中取出檢測液用HPLC法檢測AMB濃度,取樣結束后,再次檢測TEER值,確認實驗結束后Caco-2單層細胞的完整性。

1.4 統計學方法

應用SPSS 21.0軟件對數據進行統計分析,數據以平均數±標準差(±s)表示。組間比較采用單因素方差分析,P＜0.05為差異有顯著性。

2 結果

2.1 HPLC檢測

AMB在0～70.31μg/mL濃度范圍內,其濃度和峰面積呈良好的線性關系,相關系數為0.9999,METO在0～17.00μg/mL濃度范圍內,其濃度和峰面積呈良好的線性關系,相關系數為0.9995,阿昔洛韋在0～60.98μg/mL濃度范圍內,其濃度和峰面積呈良好的線性關系,相關系數為0.9997,精密度良好,故HPLC法檢測AMB、METO、阿昔洛韋重復性高,結果準確可靠。

2.2 Caco-2細胞單層模型完整性及功能性檢測

Caco-2細胞接種于小室培養至第21天時,加樣前和取樣后Caco-2細胞單層模型TEER值的范圍為(656±26)～(817±96)Ω·cm2,均大于200Ω·cm2,見表1,Caco-2細胞單層具有良好的致密性[16],同時低滲透性藥物阿昔洛韋的Papp(AP→BL)＜10-6cm/s,ER＜2,與文獻報道的Papp值和ER相符[17],符合低滲透性藥物的特性。羅丹明123為P-糖蛋白(pgp)外排轉運體的底物,羅丹明123的Papp(AP→BL)遠小于1×10-6cm/s,ER值遠大于2,表明Caco-2細胞單層模型高表達p-gp外排轉運體可以主動外排羅丹明123[18-19],見表2。因此,Caco-2細胞單層模型同時具備完整性和功能性,可用于轉運吸收的研究。

2.3 濃度對AMB Papp和ER的影響

如圖1A所示,AMB與Caco-2細胞共培養2 h細胞存活率≥90%的最高濃度為50μg/mL,表明50 μg/mL AMB溶液對Caco-2細胞無細胞毒性,故選擇50μg/mL AMB溶液作為AMB高劑量組,采用等比稀釋法設計AMB低、中劑量組考察濃度對AMB Papp和ER的影響。如圖1B、1C、1D所示,各組在加樣前和取樣后Caco-2細胞單層模型的TEER值均大于200Ω·cm2,表明在整個實驗過程中Caco-2細胞單層模型保持完整性,依據Papp(AP→BL)值大小判斷滲透性,Papp(AP→BL)＞10×10-6cm/s為高滲透性藥物,Papp(AP→BL)＜1×10-6cm/s 為低滲透性藥物[20]。 高滲透性對照組 METO 的 Papp(AP→BL)＞10×10-6cm/s,ER＜2,與文獻報道的Papp值和ER相符[21],METO為高滲透性藥物,AMB低、中、高劑量組的 Papp(AP→BL)均大于10×10-6cm/s,ER值均小于2,與高滲透性對照組比較,AMB低劑量組的Papp(AP→BL)值顯著降低(P＜0.01),AMB中、高劑量組無顯著性差異(P＞0.05),ER值無顯著性差異(P＞0.05),表明AMB為高滲透性藥物,AMB的滲透性隨著濃度的增加而增高,但對其吸收機制無影響。

2.4 藥物相互作用對AMB Papp和ER的影響

如圖2所示,各組在加樣前和取樣后Caco-2細胞單層模型的TEER值均大于200Ω·cm2,表明在整個實驗過程中Caco-2細胞單層模型保持完整性,AMB和METO單獨給藥和聯合給藥時,2種化合物的Papp(AP→BL)均大于 10×10-6cm/s,ER 值均小于 2。與METO單獨給藥組比較,聯合給藥組的METO Papp(AP→BL)值顯著降低(P＜0.01),與 AMB 單獨給藥組比較,聯合給藥組的AMB Papp(AP→BL)值顯著降低(P＜0.05),但是 ER值無顯著性差異(P＞0.05),表明AMB和METO聯合給藥會同時降低AMB和METO的滲透性,但對2種化合物吸收機制無影響。

表1 Caco-2細胞單層模型的TEER值(n=3,±s)Table 1 The TEER values of Caco-2 cell monolayer model

表1 Caco-2細胞單層模型的TEER值(n=3,±s)Table 1 The TEER values of Caco-2 cell monolayer model

組別Groups轉運方向Transfer direction跨上皮電阻 TEER(Ω·cm2)加樣前Before sample addition取樣后After sampling羅丹明123組Rhodamine 123 group AP→BL 746±56 710±93 BL→AP 721±81 656±26阿昔洛韋組Acyclovir group AP→BL 784±31 758±22 BL→AP 817±96 764±62

表2 羅丹明123、阿昔洛韋的滲透性(n=3,±s)Table 2 The permeability of rhodamine 123 and acyclovir

表2 羅丹明123、阿昔洛韋的滲透性(n=3,±s)Table 2 The permeability of rhodamine 123 and acyclovir

化合物Compound Papp(AP→BL)(cm/s)×10-6 Papp(BL→AP)(cm/s)×10-6滲透性高/低High permeability/Low permeability外排率ER羅丹明123 Rhodamine 123 0.14±1.84 1.80±0.31 低low 10.75±3.35阿昔洛韋Acyclovir 0.88±0.09 1.36±0.13 低low 1.55±0.25

2.5 p H對鹽酸氨溴索Papp和ER的影響

各組在加樣前和取樣后Caco-2細胞單層模型的TEER值均大于200Ω·cm2,表明在整個實驗過程中Caco-2細胞單層模型保持完整性,AMB低、中、高pH組的Papp(AP→BL)均大于10×10-6cm/s,與AMB低pH組比較,AMB中、高pH組的 Papp(AP→BL)值顯著性增加(P＜0.01),表明AMB的滲透性隨著溶媒pH值的升高而增加,見圖3。

圖1 濃度對鹽酸氨溴索Papp和ER的影響(n=3,±s)Note.METO-High permeability control group,15μg/mL METO.Low-dose AMB group-12.5μg/mL AMB.Medial-dose AMB group-25μg/mL AMB.High-dose AMB group-50μg/mL AMB.Figure 1 Effect of concentration on ambroxol hydrochloride Papp and ER

圖2 藥物相互作用對鹽酸氨溴索Papp和ER的影響(n=3,±s)Note.METO-METOused alone,15μg/mL METO.AMB used alone-25μg/mL AMB.METO+AMB-Combination of AMB and METO,15μg/mL METO,25μg/mL AMB.Figure 2 Effect of durg-drug interaction on ambroxol hydrochloride Papp and ER

3 討論

AMB是溴己新的人體內代謝物,在臨床前和臨床研究中具有廣泛的藥理作用,AMB除了應用于急性、慢性呼吸系統疾病外,近些年的研究發現AMB還具有治療帕金森病,抗腫瘤、增強抗菌活性、促進溶酶體外排等藥理作用[22-26],大劑量的AMB還可以有效減少肺癌患者術后并發癥的復發[27]。然而,AMB在臨床應用中存在胃部灼燒、惡心、嘔吐、致敏等副作用,特別是大劑量使用時其副作用會更顯著。因此,探索AMB在腸道中的轉運吸收機制,提高其生物利用度可減少臨床使用發生的副作用。

化合物在Caco-2細胞單層模型中由AP端的腸上皮細胞轉運吸收至BL端從而進入體循環中發揮藥效,因此,Papp(AP→BL)值是衡量化合物透過腸粘膜屏障轉運吸收至體循環的關鍵指標。AMB高劑量組的Papp(AP→BL)值是AMB低劑量組的1.28倍,AMB的Papp(AP→BL)值隨著濃度的增加而增高,同時AMB的ER值小于2,表明AMB的轉運方式為依賴藥物濃度的被動轉運或易化擴散[28-29]。影響被動轉運和易化擴散藥物轉運吸收的因素主要是分子大小,電荷、溶解度、脂水分配系數、藥物間的相互作用[14,30],METO的化學名為1-異丙氨基-3-[4-(2-甲氧乙基)-苯氧基]-2-丙醇,帶有2個羥基,解離常數PKa為9.70,極性表面積PSA為55.0?2,分子量為267.37,METO是水溶性小分子,其轉運方式為依賴濃度和轉運蛋白的易化擴散,其轉運吸收具有競爭性抑制的特性,故選擇METO和AMB聯合用藥,考察AMB與易化擴散類藥物聯合用藥的影響及AMB的轉運機制[29,31]。AMB單獨給藥的Papp(AP→BL)值是AMB和METO聯合給藥的1.21倍,METO單獨給藥的Papp(AP→BL)值是AMB和METO聯合給藥的1.55倍,但是聯合給藥對2種化合物的ER值無顯著影響,表明聯合給藥會同時降低2種化合物的轉運吸收,其原因可能為聯合用藥時METO和AMB競爭性的與轉運蛋白結合導致METO和AMB的Papp(AP→BL)值均降低。人體腸道的pH值范圍為5～8[32-33],所以于AP端設置了3個不同pH值考察腸液pH對AMB轉運吸收的影響,當AP端pH為8.0時,AMB的Papp(AP→BL)值分別是pH6.5的1.95倍、pH7.4的 1.32倍,AMB 的 Papp(AP→BL)值隨著AP端pH值的升高而增高,此結果可能與AMB的離子化程度高低有關,非離子型藥物比離子型藥物更容易透過腸粘膜屏障進入體循環[31]。AMB為有機弱堿性,其解離常數PKa為9.30[34],當腸液的pH值越高時,AMB的非離子型越多,離子型越少,轉運吸收的速度更快從而提高其生物利用度。

綜上所述,AMB在Caco-2細胞單層模型上為易化擴散轉運方式,聯合給藥可能會降低AMB的吸收,聯合給藥方案可按先后給藥方式進行給藥,2種藥物給藥之間有一定的時間間隔,同時提高腸液的pH值可提高AMB的轉運吸收, 。