辣木葉多糖的提取及抗氧化活性研究

初雅潔，龔加順

（1.大理農林職業技術學院，云南大理671000；2.云南農業大學食品科學技術學院，云南昆明650201）

辣木（Moringa oleifera Lam.）是一種起源于印度北部的熱帶、亞熱帶多功能植物，常綠或半落葉，廣泛分布在印度，古巴尼日利亞等地，具有營養豐富、適應性廣、抗逆性強等特點，被譽為“奇跡之樹”和“植物鉆石”。由于辣木具有辛辣味，所以取名為“辣木”，辣木又稱為“鼓槌樹”，是因其樹干像鼓槌而得名。在中國臺灣被稱為“21世紀人體保鏢”[1]，辣木與西洋參、靈芝并稱為世界植物三寶。早在數百年前就有食用辣木的記載。其因特殊的營養保健功效成為健康食品界的寵兒，營養價值與“人類營養微型寶庫”的螺旋藻相當[2]。每100 g葉粉中的多種礦物質、維生素和人體必需氨基酸的含量比世界衛生組織推薦的每日攝入標準高[3]。其中辣木葉、莖富含的VC是柑桔的6倍，VA是胡蘿卜的4倍，鈣和蛋白質的含量分別是牛奶的4倍和2倍，Mcburney等[4]研究報道，辣木的鉀含量是香蕉的10倍，鐵是菠菜的4倍，鋅、鎂含量明顯高于其他蔬菜、水果等。與大豆相比，辣木蛋白質含量為27%，總氨基酸含量為19.8%。氨基酸種類及含量均可與大豆相媲美[5]。聞向東等[6]研究表明每克印度辣木根樣品中的VC含量高達 10.35 μg/mL，鉀的含量高達 20.454 μg/g。已被廣泛應用于醫藥領域，被聯合國糧農組織指定為重要的糧食替代品用于解決欠發達地區的糧食短缺問題，向非洲和南美洲等國家推薦種植。2012年被中國綠色食品發展中心認定為“國家首推綠色食品”，同年被評為“國宴特供菜”。

多糖是一種天然活性成分，普遍存在于動植物、藻類與微生物的細胞中，多糖存在于植物的根、莖、葉、花、果及種子中。辣木作為一種功能性植物，有著廣闊的開發前景。辣木多糖為辣木中重要有效成分之一，含量豐富，是一種類似普洱茶多糖和人參多糖的一種高分子化合物。目前，關于辣木多糖的研究主要集中在提取工藝和對辣木多糖含量測定方面，而對不同產地辣木多糖的體外抗氧化活性迄今報道極少。鑒于此，本研究以辣木葉為原料，從提取辣木多糖的方法入手找到最優的提取工藝，分析得出6個不同產地辣木多糖的體外抗氧化活性，為辣木多糖分離純化及其結構測定的后續試驗打下堅實基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

辣木葉：普洱市思茅區、麗江華坪縣、楚雄元謀縣、大理賓川縣、德宏芒市、西雙版納景洪市6個地方，樣本均取自樹齡大體相近的辣木，辣木葉經干燥過300目篩，辣木品種為PKM-1改良種多油辣木。蒽酮：BBI Life Sciences；抗壞血酸：上海申博化工有限公司；三氯化鐵：天津市化學試劑三廠；鐵氰化鉀：中國成都化學試劑廠；DPPH：天津市風船化學試劑科技有限公司；其他化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

UN752型可見-紫外分光光度計：上海佑科儀器儀表有限公司；RE5210旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠；ALpHA2-4 LD型冷凍干燥器：上海空氣干燥機有限公司。

1.3 研究方法

1.3.1 辣木葉多糖提取工藝參數優化

1.3.1.1 辣木葉多糖的提取

辣木粉→70%熱水反復浸提3次→合并濾液→抽濾→減壓濃縮→石油醚萃取3次→無水乙醇沉淀→靜置過夜→離心分離→冷凍干燥→辣木粗多糖

1.3.1.2 單因素試驗

經多次預試驗，確定液料比、提取溫度、提取時間作為影響多糖提取得率的3個因素。分別做單因素試驗，通過試驗確定對辣木葉多糖提取得率的影響。

1）液料比對辣木粗多糖得率的影響

準確稱取辣木葉粉末2.00 g，固定提取溫度60℃，提取時間1h，分別考察液料比 10 ∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30 ∶1、35 ∶1（mL/g），對辣木葉粗多糖得率的影響。

2）提取溫度對辣木粗多糖得率的影響

準確稱取辣木葉粉末2.00 g，固定液料比20∶1（mL/g），提取時間 1 h，分別考察提取溫度 40、50、60、70、80、90℃對辣木葉粗多糖得率的影響。

3）提取時間對辣木粗多糖得率的影響

準確稱取辣木葉粉末2.00 g，固定液料比20 ∶1（mL/g），提取溫度 70℃，分別考察提取時間 0.5、1、1.5、2、2.5、3 h 對辣木葉粗多糖得率的影響。

1.3.1.3 正交試驗

通過單因素試驗，得到辣木葉粗多糖提取的單因素最佳提取條件。在此基礎上，通過正交試驗，采用三因素三水平正交試驗對各因素做進一步優化。具體因素水平見表1。

表1 辣木葉多糖提取正交試驗因素水平Table 1 Factors and levels for orthogonal experiment design of Moringa polysaccharides extraction

1.3.1.4 辣木葉粗多糖的得率和提取率的計算

辣木葉粗多糖得率/%=粗多糖質量/辣木粉末質量×100

1.3.2 辣木葉多糖體外抗氧化活性研究

采用化學顯色反應結合分光光度比色法，對樣品的還原力、清除DPPH自由基、清除羥自由基等抗氧化指標進行測定，以明確各樣品的抗氧化活性情況。以麗江、普洱、大理、德宏、版納、楚雄辣木葉的粗多糖為研究對象，選取濃度分別為 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL的多糖溶液，在不同產地和濃度下比較其抗氧化活性。

1.3.2.1 還原力的測定

分別精確吸取1.0 mL不同濃度的樣品溶液于離心管中，加入磷酸鹽緩沖溶液和1%鐵氰化鉀溶液各2.5mL，混勻后50℃水浴20 min。取出加入2.5mL 10%三氯乙酸溶液，于4 000 r/min離心機中離心10 min。取1.0 mL上清液于試管中，加入2.5 mL超純水和0.5 mL 0.1%三氯化鐵溶液。用超純水作參比，在700 nm處[7]測定混合溶液的吸光值，每個樣做3次平行。樣品吸光值越大表明還原能力越強。

1.3.2.2 DPPH自由基清除能力

吸取待測的不同濃度的樣品溶液1.0 mL于10 mL離心管中，加入4.0 mL DPPH甲醇溶液，混勻。室溫25℃下暗處放置10 min，在517 nm處[8-11]測定吸光值，每個樣做3次平行，求平均值。計算方法如下：

1.3.2.3 總抗氧化能力

ABTS+工作液用甲醇稀釋到吸光度為0.7±0.05（吸取1 mL ABTS+工作液加入40 mL乙醇調制），波長為734 nm[12]，加100 μL樣品于試管中，再加入3.8 mL稀釋后的ABTS+工作液，室溫25℃下放置6 min后測定吸光度，每個樣做3次平行。計算方法如下：

式中：A1為100 μL多糖樣品溶液+3.8 mL稀釋后的ABTS+工作液；A0為3.8 mL稀釋后的ABTS+工作液。

1.3.2.4 羥自由基清除能力

依次在離心管中加入0.15 mol/L FeSO4和2 mmol/L水楊酸鈉、不同濃度的樣品溶液各1 mL，最后加入6 mmol/L H2O2啟動反應，于37℃反應1 h后，用超純水作參比，在510 nm處[13-14]測定吸光值，每個樣做3次平行。吸光值越小，清除羥自由基效果越好。計算方法如下：

式中：A0為以超純水代替樣品溶液時測定的吸光值；A1為加清除劑時測定的吸光值；A2為樣品本身的本底值。

2 結果與分析

2.1 辣木葉粗多糖的提取工藝優化

2.1.1 液料比對辣木葉粗多糖得率的影響

液料比對辣木葉多糖得率的影響如圖1所示。

液料比低于20∶1（mL/g）時，辣木葉多糖得率隨液料比的增大呈現遞增的趨勢較明顯。但當液料比到20∶1（mL/g）以后，隨著液料比的增大，辣木葉多糖得率增長并不明顯。表明液料比在20∶1（mL/g）以前，提取溶劑不足，導致辣木葉多糖得率不高；而液料比達到20∶1（mL/g）時，提取溶劑已接近最高值，隨著液料比的增大，對多糖得率影響不明顯。從提取效率角度來看，提取溶劑過多會給后續的試驗增大工作量，因此，辣木葉粗多糖最適提取液料比應控制在20∶1（mL/g）為宜，多糖得率為9.89%。

圖1 液料比對辣木葉多糖得率的影響Fig.1 Effect of extraction liquid－solid ratio on the Moringa polysaccharide yield rate

2.1.2 提取溫度對辣木葉粗多糖得率的影響

提取溫度對辣木葉粗多糖得率的影響如圖2所示。

圖2 提取溫度對辣木葉多糖得率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the Moringa polysaccharide yield rate

提取溫度在70℃之前，隨著溫度的升高，辣木葉多糖得率隨著溫度的升高而增高的趨勢較顯著，繼續升高溫度對提高辣木葉粗多糖得率影響不大。這可能是因為在一定的溫度范圍內，溫度升高，辣木葉細胞結構被破壞和分子熱運動加快，有利于增強傳質從而提高辣木葉粗多糖得率；而多糖可溶物在溫度過高的情況下不穩定，其可能會發生破壞和分解，造成辣木粗多糖得率下降。因此，辣木葉粗多糖最適提取溫度應控制在70℃為宜，多糖得率為10.61%。

2.1.3 提取時間對辣木葉粗多糖得率的影響

提取時間對辣木葉多糖得率的影響如圖3所示。

在提取時間為1.5 h以前，辣木葉多糖得率隨提取時間的延長明顯增加，隨后趨于平緩最后出現下降的趨勢。這可能是因為提取一定時間后多糖在提取液中趨于飽和，辣木葉粗多糖得率趨于平衡；而隨著時間的延長，在較高的溫度下，多糖成分也可能被破壞，導致其得率降低。因此，辣木葉粗多糖最適提取時間應選擇在1.5 h為宜，多糖得率為9.68%。

圖3 提取時間對辣木葉多糖得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the Moringa polysaccharide yield rate

2.1.4 正交試驗結果

為了確定各因素對辣木葉粗多糖得率的影響大小，對提取溫度、提取時間、液料比3個因素進行正交試驗，以確定最佳的提取組合，正交試驗的結果見表2。

通過表2的極差分析可知，影響辣木葉多糖提取得率的因素大小順序為：B>A>C。根據直觀分析得出辣木多糖提取的最佳工藝條件為：A2B2C2，即提取溫度為 70 ℃，液料比 20∶1（mL/g），提取時間為 1.5 h。

2.1.5 正交試驗結果驗證

通過正交試驗得出辣木葉多糖提取的最佳提取工藝條件為A2B2C2，做3次平行試驗進行驗證。得出在此工藝條件下多糖的得率為11.48%，所得結果高于正交試驗組合中的最優組合。

表2 辣木葉多糖提取得率正交試驗結果Table 2 Results of orthogonal experiment for Moringa polysaccharide yield rate

2.2 辣木葉多糖抗氧化活性研究結果

2.2.1 還原力的測定

還原能力的大小可以用來證實抗氧化活性的強弱，不同產地和濃度的多糖還原力見圖4。

圖4 不同產地和濃度的多糖還原力Fig.4 Different regions and the concentration of polysaccharide reducing power

從圖4中看出，辣木葉多糖相對于抗壞血酸具有一定的抗氧化活性，不同產地水溶性多糖樣品的吸光值隨著樣品濃度的升高而增大，說明還原力隨著濃度的上升而不斷增強，綜合比較得出普洱多糖在6個樣品中抗氧化活性相對較強。

2.2.2 DPPH自由基清除

DPPH自由基是一種十分穩定的有機合成自由基，不同產地和濃度的多糖對DPPH自由基清除能力見圖5。

由圖5可知，試驗中隨著樣品濃度的升高，DPPH醇溶液特有的紫色在相應波長處的吸光值不斷下降，說明清除率隨樣品濃度的增加而增大，綜合比較得出普洱市辣木葉多糖在6個樣品中DPPH自由基清除能力相對較強，濃度為5.0 mg/mL時自由基清除率達到63.11%。

2.2.3 總抗氧化能力

不同產地和濃度的多糖對ABTS+自由基清除能力見圖6。

圖5 不同產地和濃度的多糖對DPPH自由基清除能力Fig.5 Different regions and the concentration of polysaccharide DPPH scavenging ability

圖6 不同產地和濃度的多糖對ABTS+自由基清除能力Fig.6 Different regions and the concentration of polysaccharide to the ABTS+radical scavenging ability

從圖6中可知，辣木多糖相對于VC具有一定的抗氧化活性，試驗中隨著樣品的加入抑制了ABTS·絡合物的生成，隨著濃度的升高，綠色的ABTS·絡合物在相應波長處的吸光值不斷下降，說明自由基清除率隨樣品濃度的增加而增大，綜合比較得出普洱多糖在6個樣品中總抗氧化能力相對較強，濃度為5.0 mg/mL時ABTS+自由基清除率達到46.36%。

2.2.4 羥自由基清除能力

不同產地和濃度的多糖對羥自由基清除能力見圖7。

圖7 不同產地和濃度的多糖對羥自由基清除能力Fig.7 Different regions and the concentration of polysaccharide of hydroxyl radical scavenging ability

從圖7中發現，辣木葉多糖相對于VC具有一定的抗氧化活性，并且對羥自由基清除率與濃度呈正相關，綜合比較得出普洱多糖在6個樣品中羥自由基清除能力相對較強，濃度為5.0 mg/mL時羥自由基清除率達到72.47%。

3 結論

采用水提醇沉法提取辣木葉多糖，分別考察了液料比、提取溫度、提取時間對辣木葉多糖提取率的影響，在單因素試驗的基礎上，采用三因素三水平的正交試驗來優化辣木葉多糖的提取工藝技術。正交試驗結果表明，辣木葉粗多糖的最佳提取工藝：液料比20∶1（mL/g），提取溫度為 70 ℃，提取時間為 1.5 h，通過3次平行驗證試驗得出，在此工藝條件下多糖的得率為11.48%。同時辣木葉多糖具有一定的體外抗氧化活性，隨著濃度的升高抗氧化能力逐漸增強，綜合分析6個不同產地辣木葉多糖的還原力、DPPH自由基清除能力、總抗氧化能力、羥基自由基清除能力，以普洱市辣木葉多糖的體外抗氧化活性最佳，其它各產地辣木葉多糖葉也具有一定的抗氧化活性。為各地辣木種植和特色產品開發提供了一定的指導依據。