?？谑信帻埢钋菔袌黾仪萸萘鞲胁《緮y帶情況分析

邱佳俊 曹世榮 陳雅倩 徐天鑫 孫遜 李善琴 王麗欣

[摘要] 目的 了解?？谑屑仪萸萘鞲胁《緮y帶情況，為該地區(qū)禽流感防控工作提供重要信息。方法 2017年1月—2018年12月對?？谑信帻埢钋菔袌黾仪莸难适米优c肛拭子進(jìn)行樣品的采集，用病毒分離和全基因組測序的方法進(jìn)行病毒的鑒定和分型，后將病毒序列上傳到基因庫中。結(jié)果 從24個月采集的600份樣品中，檢測出禽流感病毒陽性14份，陽性率為2.33%。檢出該地禽流感病毒HA亞型4種，其中 H9、H3、H5和H6所占比例分別為57.14%、21.43%、14.29%和 7.14%。NA亞型2種，N2和N6占比分別為78.57%和21.43%。禽流感病毒檢出月份為10月份、11月份、12月份、1月份，集中在12月份和1月份，其中1月份陽性率最高達(dá)24%。結(jié)論 通過采樣調(diào)查和禽流感病毒全基因組測序，得出?？谑谢钋菔袌鲋械募仪輸y帶的禽流感病毒主要為H9N2和H3N2;冬春季節(jié)為重要防控季節(jié)，提示今后?？谑星萘鞲蟹揽夭块T須加大對活禽市場禽流感的監(jiān)測及其消毒和管理，實(shí)現(xiàn)防控禽流感的目的。

[關(guān)鍵詞] 活禽市場;禽流感;病毒攜帶;家禽

[中圖分類號] R19 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1672-5654（2020）05（a）-0021-04

Analysis of Poultry Avian Influenza Virus Carrying Status in Peilong Live Poultry Market in Haikou

QIU Jia-jun1， CAO Shi-rong1， CHEN Ya-qian1， XU Tian-xin1， SUN Xun1， LI Shan-qin2， WANG Li-xin3

1.School of International Nursing， Hainan Medical College， Haikou， Hainan Province， 571199 China; 2.Shenzhen Third People's Hospital， Shenzhen， Guangdong Province， 518112 China; 3.School of Basic Medicine and Life Science， Hainan Medical College， Haikou， Hainan Province， 571199 China

[Abstract] Objective To understand the carrying status of avian influenza virus in poultry in Haikou City， and to provide important information for the prevention and control of avian influenza in this area. Methods From January 2017 to December 2018， samples were collected from throat swabs and anal swabs of poultry from the Peilong live poultry market in Haikou， and virus identification and typing were performed by virus isolation and whole genome sequencing. The virus sequence is then uploaded to the gene bank. Results Out of 600 samples collected in 24 months， 14 were positive for avian influenza virus， the positive rate was 2.33%. Four HA subtypes of local bird flu virus were detected， of which H9， H3， H5 and H6 accounted for 57.14%， 21.43%， 14.29% and 7.14%， respectively. There were two NA subtypes， with N2 and N6 accounting for 78.57% and 21.43%， respectively. Bird flu virus detection months were October， November， December， and January， concentrated in December and January， and the positive rate in January was as high as 24%. Conclusion Through sampling survey and whole-genome sequencing of avian influenza virus， it is concluded that the avian influenza viruses carried by poultry in the live poultry market in Haikou are mainly H9N2 and H3N2; the winter and spring season is an important prevention and control season， suggesting that the future of avian influenza prevention in Haikou control department must increase the monitoring， disinfection and management of bird flu in the live poultry market to achieve the purpose of bird flu prevention and control.

[Key words] Live poultry market; Avian influenza; Virus carrying; Poultry

禽流感病毒的流行給人類帶來極大的危害。禽流感病毒傳染性強(qiáng)、致病性強(qiáng)、病情發(fā)展快，一旦出現(xiàn)人感染禽流感病例，將會給人類健康帶來巨大威脅。我國雖然已經(jīng)在禽流感的致病、診斷及病原學(xué)等方面有了顯著的成果，但是目前禽流感防控形勢依然很嚴(yán)峻[1]。研究表明[2-4]活禽市場為禽流感病毒主要污染區(qū)，活禽市場暴露史或接觸史成為人們感染禽流感病毒的一個重要因素。目前，我國大量研究[5-9]著重探究活禽市場外環(huán)境中禽流感病毒流行情況，而我們的研究則通過采集活禽的咽拭子、肛拭子來直接體現(xiàn)活禽禽流感病毒攜帶情況。海南省目前為止未發(fā)現(xiàn)人感染禽流感病例，也未有相關(guān)部門對活禽市場進(jìn)行監(jiān)測，為了解海口市活禽市場內(nèi)家禽禽流感病毒攜帶情況，2017年1月—2018年12月對?？谑信帻埵袌黾仪葸M(jìn)行咽拭子和肛拭子樣品的采集，共600份，得到陽性樣品的全基因組序列，為相關(guān)防控部門提供數(shù)據(jù)，以便其做好相應(yīng)預(yù)防措施。報(bào)道如下。

1? 材料與方法

1.1? 采樣方法

連續(xù)2年每月采集?？谑信帻埵袌鰞?nèi)家禽的咽拭子和肛拭子。每月采集25只家禽的咽拭子與肛拭子，包括雞9只、鴨8只、鴿子8只，共50個拭子，25份樣本（一只家禽采集的咽拭子和肛拭子為一份樣本）。每個拭子放置到一個病毒分離采樣管中。共采集600份棉拭子，包括雞216份，鴨192份，鴿子192份。

1.2? 試劑

病毒分離采樣液包括10 g鏈霉素、12.5 g青霉素G鈉鹽、0.1 g硫酸慶大霉素、10 mL兩性霉素 B 溶液、2.5 g Albumin Bovine V（BSA），均購自上海生工生物工程股份有限公司。另加入250 mL已高壓的40%甘油，用dulbecco's modified eagle medium（DMEM）培養(yǎng)基定容至1 000 mL備用。配制后測pH在7.0～7.5 之間。病毒分離采樣液按1.2 mL/支分裝于2 mL RNaseFree EP管中。采集樣本后，將樣本置于-80℃保存，并盡快郵寄至深圳市疾病預(yù)防控制中心進(jìn)行后續(xù)接種、鑒定及全基因組測序。

1.3? 檢測儀器及試劑盒

全自動核酸提取儀選用西安天隆科技有限責(zé)任公司的自動核酸提取儀。試劑盒采用南京諾唯贊生物科技有限公司的P611-01HiScript Ⅱ One Step RT-PCR。

1.4? 檢測及分型鑒定方法

待檢樣品接種雞胚后收獲尿囊液提取核酸進(jìn)行病毒鑒定;待檢樣品雞胚接種后測定血凝效價，同時用PB1基因擴(kuò)增來進(jìn)行流感通用引物鑒定;對經(jīng)雞胚分離，禽流感通用引物PCR鑒定為陽性的病毒分離樣本進(jìn)行全基因組二代測序。

2? 結(jié)果

2.1? 禽流感病毒的陽性率

2017—2018年，從?？谑信帻埵袌龉膊杉?00份樣品，包括600份禽類咽/肛拭子，其中雞216份，鴨192份，鴿子192份，檢測出14份A型流感病毒核酸陽性，總陽性率2.33%，2017年和2018年分別為2.66%和 2.00%。雞的陽性率最高，達(dá)到3.70%，2017年和2018年分別為5.56%和1.85%;鴨的陽性率次之為2.08%，2017年和2018年均為2.08%;鴿子的陽性率為1.04%，2017年和2018年分別為0.00%和2.08%，見表1。

2.2? 禽流感病毒亞型檢出結(jié)果

從14個檢出強(qiáng)陽性的樣品中，檢出4種HA亞型，不同亞型病毒檢出率由高到低依次為H9（57.14%）、H3（21.43%）、H5（14.29%）、H6（7.14%）;檢出2種NA亞型，N2（78.57%）、N6（21.43%）;H9N2亞型檢出率最高，占比57.14%，其次為H3N2占比21.43%。

2.3? 不同亞型病毒在家禽中的分布

H9N2亞型病毒全部在雞中檢出;H3N2、H5N6、H6N6亞型病毒都有在鴨中檢出。見表2。

2.4? 不同月份的型別檢出率

檢出月份為10月份、11月份、12月份、1月份，集中在12月份和1月份，其中1月份陽性率最高達(dá)24%，12月份陽性率為16%，且這兩個月份檢出的亞型種類較多。見圖1。

3? 討論

3.1? 總體情況

2017年1月—2018年12月，持續(xù)對?？谑信帻埵袌龅碾u、鴨和鴿子進(jìn)行樣本采集，研究結(jié)果顯示陽性結(jié)果數(shù)較少。究其原因：①海南省作為從未報(bào)道過人感染禽流感病毒的省份，人感染病毒幾率低，病毒存在及流動較少;②可能與采樣技術(shù)不夠成熟有關(guān);③未對環(huán)境混合樣本進(jìn)行采集。盡管如此，結(jié)果仍提示2017年和2018年該活禽市場內(nèi)的家禽均攜帶有禽流感病毒，且主要集中在冬春季節(jié)。

3.2? 亞型檢出情況及其宿主特點(diǎn)

檢出率最高的為H9N2禽流感病毒，這與我國大量研究結(jié)果一致。H9N2禽流感病毒存在種屬屏障，禽流感病毒一般不導(dǎo)致人感染[10]，但有最新研究表示[11]該亞型毒株已突破種間屏障，能夠直接感染人導(dǎo)致人患病。對于免疫力正常的人感染該病毒后臨床表現(xiàn)并不明顯，但是對于那些免疫功能受抑制、功能低下的患者來說，他們感染禽流感病毒的后果可能會很嚴(yán)重[12]。此外，H9N2型別病毒能夠?yàn)槠渌滦颓萘鞲胁《镜某霈F(xiàn)提供基礎(chǔ)，從而產(chǎn)生新型重配病毒[13];因此，H9N2型別病毒危害不容小覷，建議活禽市場針對該型別加大防控力度。且H9N2全部在雞的咽拭子中檢出，這說明H9N2已經(jīng)在雞中形成穩(wěn)定體系，與趙聰慧等[14]的研究結(jié)果一致。鴨所攜帶的禽流感病毒亞型較多，包括H3N2、H5N6、H6N6亞型，但是這些亞型并不同時存在于同一只鴨身上，提示本地鴨的混合感染情況并不嚴(yán)重，這與趙冉等[11]的鴨多為3種以上亞型混合感染的研究結(jié)果有所不同。其原因有待進(jìn)一步采樣分析。

3.3? 禽流感病毒檢出月份分布

研究結(jié)果表示該活禽市場禽流感病毒的檢出情況具有明顯的月份集中性，這與中國疾病預(yù)防控制中心的張燁[15]的研究結(jié)果南方省份全年流行禽流感病毒不一樣，該研究結(jié)果顯示禽流感病毒核酸陽性主要集中于12月及1月，且這兩個月份檢出型別較多，這與劉紅蓮等的研究[16]提示禽流感病毒核酸陽性集中于冬春季結(jié)果相近。相較于其他城市，海南地處中國最南邊，盡管四季溫差不大，在海南的“冬春季”太陽輻射較夏秋季弱，滅活能力降低，且月平均降雨量高，這樣一來就會使得病毒存活時間變長，人感染病毒的幾率也相應(yīng)增高。此外，冬春季為候鳥遷徙季，候鳥大多集中在我國南部的湖泊、河流，而家禽大多散養(yǎng)在這些區(qū)域，那么野禽所攜帶的禽流感病毒傳播給家禽，家禽便通過交易、轉(zhuǎn)運(yùn)至人流量大、活動頻繁的活禽市場[17]。因此，在海南，冬春季節(jié)應(yīng)重點(diǎn)落實(shí)對活禽市場的防控。

3.4? 預(yù)防措施

根據(jù)實(shí)地考察了解到，培龍活禽市場的防控措施為一天一清洗消毒，一月一休市。但結(jié)果顯示此市場H9N2亞型病毒檢出率最高，且全部在雞的咽拭子中檢出很大可能與水源污染有關(guān);采樣時發(fā)現(xiàn)活禽市場地面總是潮濕，這有利于禽流感病毒通過水源傳播。由此看來，該活禽市場的禽流感預(yù)防措施、消毒制度等仍有所欠缺。有研究指出禁止活禽過夜能有效降低市場的禽流感病毒污染情況，尤其能夠降低雞所攜帶的H9N2型別病毒[18]。此外，很多國內(nèi)[7-9，19]研究中有提到禽流感病毒大多存在于宰殺禽類的案板以及清洗禽類的污水和禽類飲用水中，這也可能與H9N2全部在咽拭子中檢出有關(guān)。所以培龍市場可在采取休市、禁止活禽過夜措施的基礎(chǔ)上再做到合理處理污水并管理好禽類飲用水來減少H9N2病毒的存在。

該次研究的采樣范圍和對象都具有局限性，應(yīng)在下一階段的研究中擴(kuò)大采樣范圍并對環(huán)境混合樣本進(jìn)行采集，進(jìn)一步驗(yàn)證該課題現(xiàn)階段得出的結(jié)論H9N2全部在雞的咽拭子檢出與水源污染有關(guān)，并著重解決為什么鴨攜帶多種亞型卻不存在混合感染這一問題，從而更好地為?？谑星萘鞲蟹揽毓ぷ魈峁┮罁?jù)。

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（收稿日期：2020-02-07）