四味穿心蓮散中大青葉的薄層色譜定性鑒別方法

班燕桃，嚴 明，嚴 寒，單乃榮，吳 濤，陳 幸，陳寶宇

(廣西獸藥監察所，南寧 530001)

四味穿心蓮散是由穿心蓮、辣蓼、大青葉、葫蘆茶四味中藥材經粉碎、過篩、混勻制成的，收載于《中華人民共和國獸藥典》2015年版二部的成方制劑，具有清熱解毒、除濕化滯的功能，主要用于泄痢和積滯的治療[1]。在目前的質量控制方法中，收載了3味中藥的顯微特征鑒別和穿心蓮的薄層鑒別方法。組方中的大青葉為十字花科植物菘藍IsatisindigoticaFort.的干燥葉，主要化學成分為吲哚類、喹唑酮類、芥子苷類、有機酸類和氨基酸類化合物等[2]，大青葉抗氧化活性成分主要集中在極性較低的化學組分中，其主要有效成分為吲哚類、喹唑酮類和有機酸類化合物，糖類和氨基酸類化合物的抗氧化活性較弱[3]。藥理研究表明，其具有較強的抗菌、抗病毒、增強機體免疫力、解熱、抗炎、利膽等作用[4]。為了完善本產品的質量控制方法，提高產品質量，本文對組方中大青葉的薄層鑒別方法進行了研究。結果表明所建立的方法簡單、快速、靈敏，可以作為該散劑的質量控制標準。

1 材料與方法

1.1 儀器 上海精密科學儀器有限公司YP802N電子天平，感量0.01 g；KQ-250DB型數控超聲波清洗器；微量移液器5 μL，美國Drummond Microcaps?微量毛細管；硅膠G薄層板(200 mm×200 mm，MERCK公司，批號：HX87777184)；雙槽玻璃層析缸。

1.2 試劑 大青葉對照藥材(中國食品藥品檢定研究院，批號121367-201403)、甲醇、環己烷、丙酮、三氯甲烷均為分析純。

1.3 供試品 自配四味穿心蓮散樣品1批，從廣西玉林市藥材市場購進原料藥材，按《中華人民共和國獸藥典》2015年版二部收載的藥材標準檢驗符合規定。按成方制劑四味穿心蓮散的處方投料，混合粉碎，過二號篩，混勻，即得。分別派員監制獲得企業A樣品，批號20170901、20170902、20170903；企業B樣品，批號20171001、20171002、20171003；企業C樣品，批號20171201、20171202、20171203。

1.4 陰性對照樣品 未添加大青葉的“四味穿心蓮散”同供試品制法制得。

1.5 供試品溶液的制備 取供試品2.5 g，加甲醇30 mL，浸泡30 min，超聲30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加三氯甲烷1 mL溶解，作為供試品溶液。

1.6 對照品藥材溶液的制備 取大青葉對照藥材0.5 g，加甲醇30 mL，浸泡30 min，超聲30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加三氯甲烷1 mL溶解，作為對照藥材溶液。

1.7 陰性對照溶液的制備 取不含大青葉的“四味穿心蓮散”陰性對照樣品2.5 g，按照1.5項下的方法，制成陰性對照溶液。

1.8 薄層鑒別與檢視方式 吸取上述兩種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環己烷-三氯甲烷-丙酮(4.8∶9∶0.5)為展開劑，預飽和30 min，展開，取出，立即觀察。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，分別顯相同的藍色斑點和淺紫紅色斑點。

2 結果與分析

按獸用中藥質量標準分析方法驗證指導原則進行方法驗證，結果如下。

2.1 重復性試驗 采用3家企業各3批供試品，按1.5項下制成供試品溶液進行實驗，圖1實驗結果表明該方法重復性好，溶液中待測成分穩定。

1.陰性樣品(缺大青葉) 5μL；2.大青葉對照藥材5μL；3-5.企業B供試品(20171001、20171002、20171003) 5μL；6-8.企業A供試品(20170901、20170902、20170903)5μL；9-11.企業C供試品(20171201、20171202、20171203) 5μL；12.自制樣品 5μL1.Negative sample without Isatidis Folium 5μL；2.Isatidis Folium control herbs 5μL；3-5.Test article of B factory (20171001、20171002、20171003) 5μL；6-8.Test article of A factory (20170901、20170902、20170903)5μL；9-11.Test products of C factory (20171201、20171202、20171203) 5μL；12.Self made sample 5μL圖1 薄層板(MERCK)Fig 1 TLC (MERCK)

2.2 重現性試驗 在不同實驗室復核結果中，在使用規格為(100 mm×200 mm)的薄層板時，青島海洋化工廠分廠(批號20160402)和煙臺市化學工業研究所(批號111218)的分離效果好，分別顯相同的藍色斑點和淺紫紅色斑點，陰性無干擾(圖2、圖3)，使用MERCK公司薄層板(批號HX61216826)時，當上行展開7 cm，存在斑點前沿稍滯后，靛玉紅斑點分離良好，靛藍斑點與其他斑點有時不能完全分離，會影響結果判定(圖4)，在實驗時可適當伸長展距，得到良好的分離效果。

2.3 耐用性試驗 此薄層色譜鑒別方法在相同來源不同批號(青島海洋化工廠分廠：20170410、20180616、20181212)和相同規格(100 mm×200 mm)不同來源的薄層板(手工鋪制：20190220、青島海洋化工廠分廠：20180616、煙臺市化學化工研究所：20181109)上的分離效果相近，分別顯相同的藍色斑點和淺紫紅色斑點，陰性無干擾。在不同溫度、濕度條件下，色譜圖的分離效果相近，表明該展開條件受溫度濕度的影響較小，可靠性強。

1.陰性樣品(缺大青葉) 5 μL；2.大青葉對照藥材5 μL；3-5.企業B供試品(20171001、20171002、20171003) 5μL；>6-8.企業A供試品(20170901、20170902、20170903)5μL；9-11.企業C供試品(20171201、20171202、20171203) 5 μL；12.自制樣品5 μL;1. Negative sample without Isatidis Folium 5 μL；2.Isatidis Folium control herbs 5 μL；3-5.Test article of B factory (20171001、20171002、20171003)5μL； 6-8.Test article of A factory(20170901、20170902、20170903)5μL；9-11.Test products of C factory (20171201、20171202、20171203)5 μL；12.Self made sample 5μL圖2 薄層板(青島海洋化工廠分廠)Fig 2 TLC (Qingdao Ocean Chemical Plant Branch)

1.陰性樣品(缺大青葉) 5 μL；2.大青葉對照藥材5 μL；3-5.企業B供試品(20171001、20171002、20171003) 5 μL；6-8.企業A供試品(20170901、20170902、20170903)5μL；9-11.企業C供試品(20171201、20171202、20171203) 5 μL；12.自制樣品5 μL;1.Negative sample without Isatidis Folium 5 μL；2.Isatidis Folium control herbs 5 μL； 3-5.Test article of B factory (20171001、20171002、20171003)5 μL；6-8.Test article of A factory(20170901、20170902、20170903)5μL；9-11.Test products of C factory(20171201、20171202、20171203)5 μL；12.Self made sample 5 μL圖3 薄層板(煙臺市化學工業研究所)Fig 3 TLC (Yantai Institute of chemical industry)

1.陰性樣品(缺大青葉) 5 μL；2.大青葉對照藥材5 μL；3-5.企業B供試品(20171001、20171002、20171003) 5 μL；6-8.企業A供試品(20170901、20170902、20170903)5μL；9-11.企業C供試品(20171201、20171202、20171203) 5 μL；12.自制樣品5 μL1.Negative sample without Isatidis Folium 5 μL；2.Isatidis Folium control herbs 5 μL；3-5.Test article of B factory(20171001、20171002、20171003)5 μL；6-8.Test article of A factory(20170901、20170902、20170903)5 μL；9-11.Test products of C factory(20171201、20171202、20171203)5 μL；12.Self made sample 5 μL圖4 薄層板(MERCK)Fig 4 TLC (MERCK)

3 討論與結論

3.1 提取方法的優化 按《中華人民共和國獸藥典》2015年版二部第29頁中收載的大青葉薄層鑒別方法(2)進行驗證，色譜結果中供試品與對照藥材相應的位置上，展開結果靛藍斑點位置上無干擾，靛玉紅斑點有黃綠色雜質干擾。在供試品溶液的制備方法中考察了不同溶劑、溶劑用量比例及提取方式：①取樣品加三氯甲烷超聲提取，濾過，濾液蒸干，三氯甲烷溶解作為供試品溶液；②取樣品加無水乙醇超聲提取，濾過，濾液蒸干，三氯甲烷溶解作為供試品溶液；③取樣品加甲醇超聲提取[5]，濾過，濾液蒸干，三氯甲烷溶解作為供試品溶液；④取樣品加甲醇浸泡[6]30 min再超聲提取，濾過，濾液蒸干，三氯甲烷溶解作為供試品溶液。結果以方法④效果較好。選擇甲醇作為本研究的提取溶劑，主要考慮到用量比較大，且甲醇屬于低毒毒性，穩定性良好，而氯仿毒性較強，也有文獻報道靛玉紅在氯仿溶劑中穩定性較差[7]，同時也改善樣品溶液的粘稠度，易于點樣。

3.2 展開劑的優化 展開劑考察中進行了苯-三氯甲烷-丙酮(5∶4∶1)[1,8]、苯-三氯甲烷-丙酮(5∶4∶2)[9]、環己烷-三氯甲烷-丙酮-甲醇(5∶8∶0.5∶1)、環己烷-三氯甲烷-丙酮-甲醇(5∶8∶1∶1)、環己烷-三氯甲烷-丙酮(4.8∶8∶1)、環己烷-三氯甲烷-丙酮(4.8∶9∶0.5)等試劑不同配比試驗研究，因為苯的毒性大，長期使用會對檢測工作人員的身體健康造成危害，也會對環境造成一定影響，所以最終選擇低毒的環己烷代替苯作為展開劑的一種。結果表明前五種配比試驗樣品斑點有干擾，色譜分離度較差，不予采用，而以環己烷-三氯甲烷-丙酮(4.8∶9∶0.5)作為展開劑得到的色譜分離度及斑點相對位置重現性好。為避免產生邊緣效應，本展開劑系統應至少飽和半個小時，展開時應保持密閉狀態。

3.3 薄層板的選擇 參照《中華人民共和國獸藥典》中大青葉藥材的薄層鑒別方法選擇使用硅膠G薄層板，在重現性實驗中，當使用規格為100 mm×200 mm MERCK薄層板時，出現影響結果判定的現象(圖4)。MERCK板是進口產品，購買時間較長，相對其他板價格昂貴，目前采用進口板的實驗室相對比較少。而使用青島海洋化工廠分廠和煙臺市化學工業研究所薄層板時，達到很好的分離效果，重現性較好，陰性無干擾(圖2、圖3)。這兩種板屬于國內生產產品，在市面上容易購得，價格也比較實惠，可以降低分析成本，得到大多數實驗室的青睞。雖有瑕疵，但對方法使用影響較小。

3.4 對照藥材的選擇 由于我國南北緯度、氣候等因素差異較大，不同產地生產的大青葉外觀品質和質量之間會有很大差異，從而引起有效成分種類和成分間配比的變化[10]。由于樣品提取成分復雜，經實驗分別采用大青葉對照藥材與靛藍、靛玉紅對照品作為質控指標相比較，在薄層鑒別上采用大青葉對照藥材作為質控指標產生靛藍、靛玉紅斑點大小合適，顏色清晰，專屬性強，可同時解決復方組成藥味的真偽(或有無)和優劣(或劑量)等問題，已達到質量控制的效果，所以選用大青葉對照藥材為參照。由于靛藍易氧化褪色，薄層板取出后應立即觀察。

本研究建立了四味穿心蓮散中大青葉的薄層色譜鑒別方法，說明四味穿心蓮散的質量可控，且方法簡便，方法專屬性強，可為建立和完善四味穿心蓮散中大青葉的質量標準提供依據。