木豆葉提取物對股骨頭壞死大鼠血液流變學及骨髓間充質干細胞分化的影響

趙飛，姚忠軍，胡炳炎，劉東

股骨頭壞死是骨科常見且難治性疾病，30～50歲人群的發病率較高[1]，病情進展速度快，若未及時干預治療，可在短短幾年內發展為股骨塌陷或髖關節繼發性骨性關節炎，只能采取髖關節置換術救治，但髖關節置換術費用較高[2]。目前對股骨頭壞死發病機制認識尚未清楚，導致其治療難度大且療效不明顯[3]，既往研究顯示，中醫治療股骨頭壞死具有一定的療效且安全性好[4-5]。木豆葉是豆科木豆屬植物木豆的莖葉，具有消腫解毒的功效，對股骨頭缺血性壞死有顯著預防作用[6]。股骨頭壞死危險因素較多，包括使用糖皮質激素、系統性紅斑狼瘡、關節移位及酗酒等[7]。本研究通過構建激素性股骨頭壞死大鼠，觀察木豆葉提取物對股骨頭壞死大鼠血液流變學及骨髓間充質干細胞(BMSCs)分化的影響，為臨床木豆葉提取物治療股骨頭壞死提供實驗依據，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)動物： SPF級雄性SD大鼠50只，4周齡，體質量(190±20)g，購于中山大學東校區實驗動物中心[SCXK(粵)2016-0029]，SPF級飼養環境常規飼養，培育室溫度20～25 ℃，濕度50 %～55 %，進行人工光照(12 h/晝、12 h/夜)，大鼠全天自由飲水。(2)藥物與試劑：甲基強的松龍(美國Target Molecule Corp公司)，木豆葉提取物采用通絡生骨膠囊，購于浙江海正藥業股份有限公司。大腸桿菌脂多糖(美國Sigma公司)，三酰甘油(中國上海朗頓生物科技有限公司)，堿性磷酸酶(ALP)試劑盒、大鼠骨鈣素(BGP)ELISA試劑盒(中國上海恒斐生物科技有限公司)。 (3)儀器：冷凍離心機(5702R型，德國Eppendorf公司)，輪盤式切片機(RM2016型，德國LEICA公司)，多功能酶標儀(EnVision型，英國珀金埃爾默公司)，顯微鏡(LV-150N型，日本NIKON公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠模型制備及干預: 2017年10月—2018年12月于湖北省十堰市太和醫院生物醫學研究所進行實驗。大鼠適應性飼養1周，隨機數字表法分為對照組、模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組,每組10只 ，參考文獻[8]將后4組大鼠用于激素性股骨頭壞死動物模型制備：大鼠尾靜脈注射大腸桿菌脂多糖40 μg/kg，1次/d，連續注射2 d，末次注射后次日予甲基強的松龍20 mg/kg臀肌注射，1次/d，連續注射3 d；對照組大鼠注射等劑量的生理鹽水。在建模的同時，低劑量組、中劑量組、高劑量組分別給予通絡生骨膠囊混懸液0.48、0.96、1.44 g/kg灌胃干預，1次/d，對照組等體積的生理鹽水灌胃，均連續干預4周。大鼠股骨頭肉眼可見軟骨面存在缺損，壞死面顯露并且髓腔內存在脂肪堆積等變化[9]，表明模型制備成功。

1.2.2 BMSCs分離培養: 各組大鼠麻醉處死，于無菌條件下分離股骨與脛骨，去除附著肌肉組織，去掉兩端干骺端，采用10%PBS、IMDM培養基沖洗骨髓腔至發白，收集洗滌液，無菌網過濾，其中液體培養于6孔板中，37 ℃、5 %CO2培養箱中靜置培養，3 d更換1次培養基，當細胞鋪滿近80%時，進行傳代培養，取第3代BMSCs用于分化實驗。同時取對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠干預結束后2 h的心臟血3 ml，于4 ℃離心收集上層血清，-20 ℃保存備用。

1.2.3 BMSCs分化干預: 將第3代BMSCs分為空白組、處理組。處理組分為3個亞組，分別為低劑量亞組、中劑量亞組、高劑量亞組，每組6個復孔，重復3次，其中培養基中分別加入1.2.2所述的含藥血清，空白組不做藥物處理，參考文獻[10]中的方法，連續干預1周。

1.3 觀察指標與方法

1.3.1 血液黏度及凝血指標檢測：于大鼠給藥干預結束后2 h，1%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉，采取心臟血3 ml置于含有肝素的抗凝管中備測，采用全自動分析儀檢測全血黏度、血漿黏度，凝血酶原時間(PT)、活化部分凝血活酶時間(APTT)、凝血酶時間(TT)。

1.3.2 骨組織病理學觀察： 藥物連續干預4周后，麻醉處死各組大鼠，切開皮膚，分離肌肉組織，暴露關節囊，取出右側股骨頭并置于4%多聚甲醛溶液中固定，用于蘇木精—伊紅(HE)染色，進行病理學觀察。

1.3.3 TG、ALP、BGP檢測：各組含藥血清干預結束后，收集BMSCs細胞，1 000 r/min離心10 min，PBS洗滌細胞3次，沉淀細胞并收集，裂解細胞，3 000 r/min離心30 min，收集上清液，按照TG、ALP、BGP試劑盒說明書進行操作。

1.3.4 鈣化結節面積檢測：采用硝酸銀染色觀察各組鈣化結節情況，BMSCs分化干預結束后，棄培養液，PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定10 min，5%硫代硫酸鈉作用30 min，再用蒸餾水漂洗3次，1%硝酸銀UV染色30 min，蒸餾水沖洗掉黑色物質，5%硫代硫酸鈉作用2 min，1%中性紅復染10 min，蒸餾水漂洗，在Polarid DMCⅡ圖像分析儀下進行鈣化結節面積觀察。

2 結 果

2.1 各組血液流變學指標比較 與對照組比較，模型組大鼠全血低切黏度、全血中切黏度、全血高切黏度、血漿黏度均增加(P<0.01)；與模型組比較，低劑量組、中劑量組、高劑量組均降低(P<0.05)；隨著木豆葉濃度增加，低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠血液黏度逐漸降低，差異均有統計學意義(P均<0.05)，見表1。

2.2 各組凝血功能比較 與對照組比較， 模型組大鼠PT、APTT、TT均降低(P<0.01)；與模型組比較，低劑量組、中劑量組、高劑量組均升高(P<0.05)；隨著木豆葉濃度增加，低劑量組、中劑量組、高劑量組凝血時間逐漸增加(P均<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠凝血功能指標比較

注：與對照組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.05

2.3 各組骨組織病理學比較 對照組大鼠股骨頭軟骨細胞排列有序，骨小梁完整，空骨陷窩較少，未見細胞壞死。模型組大鼠股骨頭軟骨細胞排列紊亂且肥大，骨小梁變窄，有空骨陷窩，脂肪細胞變大，可見明顯壞死細胞。低劑量組、中劑量組及高劑量組大鼠股骨頭損傷情況得到改善，其中高劑量組大鼠股骨頭改善狀況更明顯，見圖1。

2.4 BMSCs分化比較 與空白組比較，處理組(低劑量亞組、中劑量亞組、高劑量亞組)的BGP水平、鈣化結節面積及ALP活性升高，TG水平降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；隨著木豆葉含藥血清濃度增加， BGP水平、鈣化結節面積及ALP活性也逐漸升高，TG水平逐漸降低(P<0.05)，見表3。

3 討 論

股骨頭壞死屬于退行性、破壞性骨病，其病程時間長且致殘率較高，嚴重影響患者日常生活。目前對股骨頭壞死的發病機制尚未明確，但普遍接受血管內凝血學說、脂代謝紊亂學說、細胞凋亡學說及激素毒性作用等，盡管各種學說的側重點不一，但最終都會影響骨微循環[10]。本研究結果發現，與對照組大鼠比較，激素性股骨頭壞死大鼠全血黏度呈現出升高狀態，而PT、APTT、TT降低，由此表明激素性股骨頭壞死大鼠體內表現出高凝狀態。高凝狀態、高游離脂肪酸會加快血管內皮損傷，使血管局部凝血加重，促使軟骨下微循環障礙、血栓形成，升高骨內壓、減少血流量，引起缺血缺氧，最終形成股骨頭壞死[11-12]。本研究發現通過木豆葉提取物干預后可以明顯降低激素性股骨頭壞死大鼠全血黏度，并且還可以延長PT、APTT、TT時間，可能是因為木豆葉本身具有消腫止痛、活血化瘀等作用，改善激素性股骨頭壞死大鼠的血循環狀態，從而改善激素性股骨頭壞死大鼠高凝狀態。

表1 各組大鼠血液流變學指標比較

注：與對照組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.05

表3 各組大鼠BMSCs分化情況比較

組 別nBGP(μg/L)鈣化結節面積(mm2)TG(μg/ml)ALP(U/ml)空白組6214.31±13.2532.11±3.042.89±0.21129.62±8.64處理組 低劑量亞組6233.67±12.34 36.25±2.65 2.11±0.23 141.65±9.44 中劑量亞組6250.41±13.36 40.21±3.44 1.83±0.16 155.99±9.62 高劑量亞組6269.84±14.32 45.83±3.69 1.52±0.14 168.27±9.03 F/P值18.914/0.00019.659/0.00058.108/0.00020.140/0.000

經過對激素性股骨頭壞死大鼠股骨頭病理檢查發現染色，股骨頭表現出壞死、骨小梁空骨陷窩、骨細胞壞死、脂肪細胞增大等病理癥狀，而經過木豆葉提取物干預處理可以改善上述病理癥狀，并且隨著作用濃度的增加改善程度越明顯。有研究顯示[13]，由木豆葉單味藥組成的通絡生骨膠囊可以促進新西蘭兔激素性股骨頭壞死修復，減少股骨頭壞死的發生率，本研究結果也支持其觀點。中醫認為氣血在股骨滋養、骨質正常形態及其功能的維持中具有重要作用，木豆葉不僅具有活血化瘀的功效，還具有抗炎、抗腫瘤、降血脂、抗骨質疏松等作用，化學成分主要有黃酮類、芪類、豆甾醇、兒茶酚、水楊酸等[14-15]，其中木豆葉芪類通過影響膽固醇逆向轉運實現對膽固醇代謝的調節作用及血管保護作用，木豆葉黃酮類還可以促進新生骨鈣的沉積及磷含量，增強對股骨頭壞死部分的修復作用，此外，木豆葉中還含有豆甾醇、兒茶酚、水楊酸等物質，但能否對激素性股骨頭壞死有改善作用，還需要進一步研究。由此表明，木豆葉提取物對激素性股骨頭壞死有改善作用，推測可能與影響骨鈣沉積或BMSCs分化有關。

本研究通過激素性股骨頭壞死大鼠模型制備BMSCs，經含木豆葉提取物血清干預后，BMSCs中TG水平減低，而ALP活力、骨鈣素水平、鈣化結節面積明顯升高。BMSCs起源于骨髓成體干細胞，具有增殖、多向分化功能，經不同誘導因素刺激可以分化成神經細胞、肝細胞、軟骨細胞、成骨細胞等[16]。BMSCs具有向成骨分化、成脂分化的能力，脂肪細胞主要特點為合成并存儲TG，所以TG可以反映BMSCs成脂分化情況。ALP是BMSCs向成骨細胞分化的早期重要指標，ALP活性也直接反映BMSCs向成骨細胞分化的能力。BMSCs向成骨細胞分化的最終表現為鈣化，鈣化結節可以反映最終鈣化情況。劉長河等[17]研究顯示，木豆葉提取物可以較好改善維甲酸誘導的大鼠骨質疏松，增加股骨、椎骨的骨鈣水平。本研究結果也發現，大量激素作用可以促進BMSCs脂肪代謝紊亂、分化異常，血液的黏稠度增加，血脂水平異常升高，血栓形成引起栓塞，導致股骨頭供血不足，從而引起骨細胞壞死。木豆葉提取物對BMSCs成骨分化有促進作用，可能是提高了BMSCs的應激性及自我保護，抑制BMSCs凋亡，還有可能是通過影響MAPK途徑[18]，但其中的具體作用機制還需要進一步研究。

綜上所述，木豆葉提取物對激素性股骨頭壞死大鼠的血液黏度、凝血功能有一定的改善作用，可能通過增強BMSCs向成骨分化能力，促進激素性股骨頭壞死大鼠股骨頭壞死修復。