超高效液相色譜法測定氯氮平有關物質

邱榮榮 朱娟 孫潔（常州制藥廠有限公司，江蘇常州213000）

0 引言

氯氮平對精神分裂癥的陽性或陰性癥狀具有較好的療效，被稱為“全新的第四代抗精神病藥”，屬于我國基本藥物。各國藥典[1-3]均有收載，而我國現行藥典僅用HPLC自身對照法控制雜質總量，缺少對特殊雜質研究，而國外藥典均已明確控制相關的特殊雜質。在前期研究過程[1-7]中發現，各國藥典檢測方法都不能很好分離本論文確定已知雜質和特殊未知雜質，且分析時間較長、分離度較差問題。查閱文獻結合檢驗效率要求，開發了超高效液相色譜法(UPLC)測定氯氮平有關物質檢驗方法。文章建立UPLC 法操作簡單準確測定氯氮平中各雜質，可用于氯氮平有關物質質量控制。

1 儀器與試藥

Waters超高壓液相色譜儀、Empower3軟件；梅特勒-托利多XPE205 電子天平、FE20 pH 計。氯氮平原料藥(常州制藥廠有限公司，批號190730）；氯氮平對照品(中檢所，批號100323-201102)；雜質A,B,C,D,E,5(常州制藥廠有限公司)；甲醇為色譜純；磷酸二氫鉀、磷酸為分析純；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色 譜 柱：Agilent Rapid Resolution HD (2.1 mm×150mm 1.8μm)；；流速：0.35 mL·min-1；檢測波長：257 nm；柱溫：35℃；進樣量：2μl；以2‰磷酸二氫鉀水溶液(pH2.4)：甲醇(75：25)為流動相(A)；以2‰磷酸二氫鉀水溶液(pH2.4)：甲醇(10：90)為流動相(B)；以甲醇：水(80：20)為稀釋液；進行0～2分流動相(A)100%、2～13分流動相(A)100%至0%、13～15分流動相(B)100%梯度洗脫。

2.2 溶液的制備

稱取雜質A,B,C,D,E,5 對照品各7.5mg 于100ml 量瓶中，加80ml 甲醇溶解并加水稀釋至刻度，搖勻；稱取氯氮平對照品75mg 于100ml 量瓶中，加80ml 甲醇溶解，移取上述溶液5ml 于同一100ml 量瓶中，加水定容，搖勻作為系統適用性溶液；稱取本品75mg 于100ml 量瓶中，加80ml 甲醇溶解并用水稀釋至刻度，搖勻作為供試品溶液；移取1ml 供試品溶液置100ml 量瓶中，加稀釋液稀釋至刻度，搖勻，再移取5ml 于50ml 量瓶中，加稀釋液稀釋至刻度，搖勻作為對照溶液。

2.3 專屬性試驗

取系統適用性溶液照“2.1”項色譜條件進樣分析，系統適性圖譜(見圖1.)。結果表明，氯氮平與各雜質峰均能達到良好的分離，分離度可達到4.0以上。

2.4 降解試驗

稱取本品75mg 共9 份，分別置于100ml 量瓶中，分別進行酸破壞(加5ml 的0.1mol·L-1 鹽酸溶液，放置4 小時，加0.1mol·L-1 氫氧化鈉溶液5ml 調pH 至中性)、堿破壞(加5ml 的0.1mol·L-1 氫氧化鈉溶液，放置10 分鐘，加0.1mol·L-1 鹽酸溶液5ml調pH至中性)、氧化破壞(加4ml 10%雙氧水于60℃水浴放置10分鐘)、光照破壞(置于4500LUX±500LUX 光照12 天)、高溫破壞(置于105℃放置4 小時)、高濕破壞(置RH92.5%放置12 天)和未破壞均加80ml甲醇溶解并用水稀釋至刻度，搖勻作為供試品溶液。照“2.1”項下色譜條件測定上述溶液，降解試驗結果表明，氯氮平主峰及各雜質峰(降解雜質峰)均能達到良好的分離，峰純度均符合要求(峰純度閾值大于峰純度角值)，且質量保持平衡，氧化加熱破壞下雜質A和E增大較大，其它破壞影響較小。說明本方法專屬性好，能夠有效檢測樣品中的降解產物。

2.5 線性及校正因子

稱取氯氮平及雜質A,B,C,D,E,5 對照品各15mg 置同一200ml量瓶中加160ml甲醇溶解并用水稀釋至刻度，搖勻，分別移取0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 ml 置100ml 量瓶稀釋液溶解稀釋至刻度搖勻作為線性溶液。照“2.1”項下色譜條件測定上述溶液，由濃度(μg/ml)對峰面積做線性回歸方程及校正因子，線 性 方 程 分 別 為Y=19917.7X+313.8、Y=23587.2X-9.8、Y=19655.2X-220.3、 Y=16986.8X+142.5、 Y=7371.9X+63.7、 Y=13021.3X+9.6、Y=8223.1X+20.5；相關系數均大于0.9995在相應濃度范圍內線性良好；校正因子分別為0.8、1.0、1.2、2.7、1.5、2.4。

2.6 回收率試驗

圖1 系統適用性圖譜Fig.1Chromatogram of system suitability

稱取雜質A,B,C,D,E,5 對照品各15mg 置同一200ml 量瓶中加160ml 甲醇溶解并用水稀釋至刻度，搖勻作為回收率雜質貯備液。稱取氯氮平樣品75mg共12份，分別置于100ml量瓶中，分別移取0.5、1.5、3.0ml 回收率雜質貯備液各3 份加80ml 甲醇溶解并用水稀釋至刻度，搖勻作為回收率供試品溶液。照“2.1”項下色譜條件測定上述12 份溶液，計算各雜質回收率分別為97.8%、102.8%、107.4%、92.3%、104.1%、103.7%和RSD 分別為1.2%、1.4%、1.4%、8.1%、1.0%、1.2%。表明本方法雜質回收率良好。

2.7 檢測限和定量限

稱取氯氮平及雜質A,B,C,D,E,5 對照品各7.5mg 分別置100ml量瓶中加80ml甲醇溶解并用水稀釋至刻度，搖勻，移取相應溶液適量，用稀釋液逐級稀釋，照“2.1”項下色譜條件進樣分析，按信噪比S/N=10 計算定量限0.11、0.03、0.13、0.11、0.28、0.12、0.11μg.ml-1，均低于相當于主成份0.05%限度水平，且連續6 針峰面積RSD 均小于5.0%；按信噪比S/N=3 計算檢測限分別為0.03、0.01、0.04、0.03、0.08、0.04、0.03μg.ml-1均低于相當于主成品0.01%限度水平。

2.8 精密度試驗

照“2.1”項下色譜條件，連續測定對照溶液6 針，主峰峰面積RSD小于1.0%，表明本法精密度良好。

2.9 重復性試驗

稱取氯氮平樣品75mg 6 份，分別置于100ml 量瓶中，分別移取1.5ml 回收率雜質貯備液(相當于主成份0.15%)加80ml 甲醇溶解并用水稀釋至刻度，搖勻作為重復性試驗溶液，照“2.1”項下色譜條件，連續測定上述6份溶液，計算6份溶液中各雜質含量RSD均小于5.0%，表明本法精密度良好

2.10 耐用性考察

根據“2.1”項下色譜條件，分別改變柱溫(33、37℃)、流速(0.33、0.37ml/min)、波長(255、259nm)、pH(2.35、2.45)、流動相A兩相比例(74：26、76：24)和流動相B兩相比例(9：91、11：89)進行系統適應性溶液試驗，結果表明上述色譜條件下，氯氮平與各雜質峰間均能達到較好分離，其參數的微小變化不影響檢測，表明本方法耐用性較好。

3 結語

本UPLC 法各雜質分離效果好、線性好、重復性好、精密度好、回收率好、分離效率高，溶劑用量少，可用于氯氮平有關物質質量控制。