微球菌MicrococcusNT_1001解磷特性研究

蔣學劍 王志強 王志清

摘要 從湯溝酒廠的酒醅樣品中分離得到一株解磷細菌，為革蘭氏陽性（G+）菌，菌落表面呈金黃色，且形態圓整，邊緣整齊，成堆排列。經16S rDNA序列比對，該菌株為微球菌，被命名為Micrococcus NT_1001。分別以KH2PO4和蛋黃卵磷脂（PC）為底物，考察Micrococcus NT_1001對無機磷和有機磷的分解性能。結果表明，Micrococcus NT_1001可降解無機磷和有機磷，且可轉化PC生產甘油磷酸膽堿（GPC）;培養溫度、pH和培養基中的初始磷濃度對磷分解率、GPC收率有顯著影響;Micrococcus NT_1001的最適生長條件為37 ℃，pH 為8.0;初始KH2PO4濃度為60 mg/L時，KH2PO4的分解率最高，為97.89%;初始PC濃度為10 g/L時，GPC收率最高，為1.33%;KH2PO4和PC都對Micrococcus NT_1001存在底物抑制作用。

關鍵詞 酒醅;微球菌;解磷;PC;GPC;底物抑制

Abstract A wild grampositive （G+） phosphatedissolving bacteria was isolated from the fermented grains samples of Tanggou Distillery.The colony surface was golden yellow，and the colony shape was round.The colony edges were neat and arranged in piles.The aligned 16S rDNA sequence indicated that this strain belonged to Micrococcus sp，which was named as Micrococcus NT_1001.The decomposition performance of Micrococcus NT_1001 on inorganic phosphorus and organic phosphorus was investigated separately by using KH2PO4 and egg yolk lecithin （PC） as substrate.The results showed that Micrococcus NT_1001 could degrade effectively inorganic phosphorus and organic phosphorus，and also convert PC to glycerol phosphate choline （GPC）;culture temperature，pH and initial phosphorus concentration in the medium had significant effects on the phosphorus decomposition rates and GPC yields;the optimal growth condition of Micrococcus NT_1001 was 37 ℃，pH 8.0;when the initial concentration of KH2PO4 was 60 mg/L，the highest decomposition rate of KH2PO4 was obtained，the corresponding value was 97.89%;when the initial PC concentration was 10 g/L，the highest GPC yield （1.33%） was obtained;both KH2PO4 and PC had substrate inhibitory effects on Micrococcus NT_1001.

Key words Fermented grains;Micrococcus;Phosphate dissolving;PC;GPC;Substrate inhibition

磷既是水體富營養化的關鍵性限制因子，也是微生物細胞生長的必需元素之一。因此，解磷不僅是環保領域的研究熱點，也是生物催化過程的研究重點之一[1]。

具有解磷作用的微生物種類較多，主要包括芽孢桿菌、沙雷氏菌、假單胞桿菌、微球菌、固氮菌、埃希氏菌、霉菌等[2-9]。無機磷和有機磷在這些微生物細胞內的降解、轉化途徑不同。其中，微生物對無機磷的降解途徑通常包括：①乳酸、氨基乙酸、草酸、延胡索酸、琥珀酸、2-葡糖酮酸和檸檬酸等有機酸溶解磷酸鹽[10-12];②通過呼吸作用降低環境pH，引起磷酸鹽溶解[13-15];③釋放H2S，并使其與磷酸鐵反應，生成硫酸亞鐵和可溶性的磷酸鹽等[16-17]。而微生物細胞對有機磷的分解是通過胞外磷酸酶的分泌和酶解過程實現。微生物從含磷有機物中的碳（C）中獲得能量，而有機物中的磷（P）則以代謝產物的形式被釋放出來[18-19]。同時，細菌具有負責轉運有機磷酸酯的G-3-P，即sn-3-磷酸甘油結合蛋白依賴性UgpBAEC轉運系統，其中UgpB是周質空間結合蛋白，UgpA和UgpE是膜內嵌蛋白，而UgpC為滲透酶。因此，解磷細菌還可能將有機磷酸酯先轉運入胞內，再進行酶解[20]。

課題組前期從湯溝酒廠的酒醅樣品中富集、篩選出若干株微生物，并分離得到一株解磷細菌。筆者擬通過形態觀察、16S rDNA序列比對對該菌株進行種屬鑒定，同時優化該菌株的培養條件，分析菌株代謝產物。

1 材料與方法

1.1 菌株 酒醅樣品采集于江蘇湯溝兩相和酒業有限公司，經富集分離后獲得單菌落。

1.2 試劑 牛肉膏、蛋白胨、NaCl 、KH2PO4、NaOH、瓊脂等生化試劑均為分析純，購自西隴科學股份有限公司;蛋黃卵磷脂（純度99.9%），西安澤邦生物科技有限公司。

1.3 儀器與設備

ZHJH-C1109C型超凈臺（上海智城分析儀器制造有限公司）;1290型HPLC（Agilent）;SX700型滅菌鍋[天美（中國）];MQD-S2R型振蕩培養箱（上海旻泉儀器有限公司）;5810R型臺式高速冷凍離心機（Eppendorf）;PHS-3C型精密pH計（上海精密儀器有限公司）;BS124S型電子天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司];NTL-16G型高速臺式離心機（上海安亭科學儀器）。

1.4 方法

1.4.1 培養基。

斜面培養基：牛肉膏 3 g/L，大豆蛋白胨 10 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂 2 g/L，pH 7.4～7.6。

平板培養基：牛肉膏 3 g/L，大豆蛋白胨 10 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂 2 g/L，pH 7.4～7.6。

液體培養基：牛肉膏 3 g/L，大豆蛋白胨 10 g/L，NaCl 5 g/L。

將培養基分裝至500 mL錐形瓶中，121 ℃滅菌20 min，冷卻后使用。

1.4.2 培養條件。

種子培養：從保存的菌株上挑取一環菌種接種于斜面培養基上，37 ℃活化24 h，500 mL三角瓶中分裝牛肉膏蛋白胨培養基100 mL，121 ℃滅菌20 min;將斜面培養基上的菌種挑取一環接入液體培養基，置于搖床培養24 h，培養條件為37 ℃，200 r/min。

發酵培養：250 mL三角瓶分裝牛肉膏蛋白胨培養基50 mL，121 ℃滅菌20 min，加入KH2PO4母液或蛋黃卵磷脂母液，用已滅菌的吸管吸取1 mL種子液至含磷的培養基中。

1.4.3 蛋黃卵磷脂母液配制。

蛋黃卵磷脂試劑為固體，不易滅菌和添加，故選擇將其配制成一定濃度的母液，以便取用。取蛋黃卵磷脂15 g，加入Milli-Q水成150 mL，得到濃度為100 g/L的蛋黃卵磷脂母液，105 ℃滅菌20 min，冷卻后放入4 ℃ 冰箱備用。

1.4.4 KH2PO4母液配制。稱取4.387 g KH2PO4，加純水溶解后定容至100 mL，得到磷濃度為10 g/L的KH2PO4母液，121 ℃滅菌20 min，冷卻后放入4 ℃冰箱備用。

1.4.5 電鍍廢水樣品處理。

采集的電鍍廢水樣品中含有較多不溶性雜質，在使用前進行離心。將水樣分別裝入200 mL離心罐中，稱重配平離心，800 r/min離心10 min;離心后的上清液收集起來，放至4 ℃冰箱備用。

1.4.6 培養溫度。

250 mL三角瓶內裝50 mL牛肉膏蛋白胨培養基，121 ℃滅菌20 min，接種1 mL 種子液，分別置于20、30、37、40 ℃搖床培養，轉速為200 r/min，培養24 h，每隔一定時間取樣，測定OD600。

1.4.7 pH。250 mL三角瓶內裝50 mL牛肉膏蛋白胨培養基，利用酸堿調pH分別為6、7、8、9，121 ℃滅菌20 min，接種1 mL種子液后置于搖床培養，轉速為200 r/min，培養24 h，每隔一定時間取樣，測定OD600。

1.4.8 無機磷濃度。

250 mL三角瓶內裝50 mL牛肉膏蛋白胨培養基，分別加入不同量的KH2PO4母液，使其濃度分別為0、20、40、60、80、100、120 mg/L，121 ℃滅菌20 min，接種1 mL 種子液，搖床培養，轉速為200 r/min，每隔一定時間取樣1 mL至2 mL離心管中，測定OD600;另取5 mL培養液至玻璃試管中，測定磷含量。

測定電鍍廢水樣品中總磷濃度，向電鍍廢水中加入牛肉膏、蛋白胨、NaCl，測定OD600和磷含量。

1.4.9 有機磷濃度。將已滅菌的蛋黃卵磷脂（PC）按計算數值加入已滅菌的牛肉膏蛋白胨培養基中，混合均勻，使其濃度分別為0、5、10、20、30 g/L，每瓶接種1 mL種子液，搖床培養，轉速設定為200 r/min，測定OD600和磷含量。

1.4.10 分析。蛋黃卵磷脂（PC）和甘油磷酸膽堿（GPC）測定：用ES 2000高效液相色譜儀搭配Alltech 2000蒸發光檢測儀，采用三元梯度洗脫（表1），流動相A為正己烷（含0.04%三乙胺），流動相B為異丙醇，流動相C為13%乙酸溶液，洗脫流速為1.5 mL/min，柱溫25 ℃。蒸發光檢測器采用分流模式，以空氣作為霧化氣，氣體流速為1.7 L/min，漂移管溫度為45 ℃。待測樣品按照一定濃度溶解于HPLC級正己烷-異丙醇（體積比為3∶1）混合液中。使用前用0.22 μm孔徑的有機相濾膜過濾。

采用鉬酸銨分光光度法測定樣品中的磷含量[21]。

采用天根生化科技（北京）有限公司的細菌基因組DNA提取試劑盒，按試劑盒操作流程提取NT_1001基因組DNA。

2 結果與分析

2.1 解磷細菌NT_1001的鑒定

菌落表面呈金黃色，形態圓整，邊緣整齊，成堆排列（圖1），且革蘭氏染色結果呈陽性（G+）（圖2）。

以NT_1001的DNA作為模板，利用通用引物27F和1492R進行 PCR擴增，擴增體系為60 μL：10 ng/μL的引物27F和1492R各3 μL，DNA模板3 μL，2×Taq mix 30 μL，無菌水補足至60 μL。反應條件為95 ℃預變性5 min;94 ℃變性45 s，55 ℃復性90 s，72 ℃延長90 s，30個循環;72 ℃延長10 min。PCR產物測序后，通過Blast將該序列與 GenBank 數據庫中序列進行同源性比對。結果表明，解磷細菌NT_1001與微球菌Micrococcus luteus 的同源性最高，其同源性系統進化樹如圖3所示。綜合形態特征和基因序列同源性分析，將菌株NT_1001鑒定為微球菌（Micrococcus sp.） 。

2.2 Micrococcus NT_1001生長條件優化

2.2.1 溫度。從圖4可以看出，培養溫度從20 ℃增加至37 ℃時，Micrococcus NT_1001的生長速率隨著溫度增加而逐漸增加;而當培養溫度為40 ℃時，Micrococcus NT_1001的生長速率降低。37 ℃是Micrococcus NT_1001生長的最適溫度。

2.2.2 pH。從圖5可以看出，pH從6.0增加至8.0時，Micrococcus NT_1001的生長速率隨著pH增加而逐漸增加;而當pH大于8.0時，Micrococcus NT_1001的生長速率降低。這表明，Micrococcus NT_1001生長的最適pH為8.0。

2.3 Micrococcus NT_1001的解磷性能

2.3.1 無機磷。

由圖6可知，培養基中KH2PO4含量對Micrococcus NT_1001生長有明顯的影響。菌體量隨著KH2PO4濃度的增加而增加。KH2PO4濃度低于60 mg/L時，Micrococcus NT_1001的生長量隨著KH2PO4濃度增加而增加;KH2PO4濃度為?除此之外，初始KH2PO4濃度對磷分解率的影響如圖7所示。從圖7可以看出，當初始KH2PO4濃度低于60 mg/L時，KH2PO4的消耗率隨著初始KH2PO4濃度增加而增加;而當初始KH2PO4濃度大于60 mg/L時，KH2PO4的消耗率逐漸降低。這表明，60 mg/L是Micrococcus NT_1001解磷時的最佳初始KH2PO4濃度，得到的KH2PO4分解率為97.89%。

由圖8可知，Micrococcus NT_1001在工業電鍍廢水中也可以生長，且生長情況良好。但是，菌株在工業電鍍廢水中的磷分解率僅為46.13%（圖9），而菌株在KH2PO4培養基中的解磷率能接近100%。與污水樣品相比，Micrococcus NT_1001在含磷液體培養基中生長情況較好。這可能是由于電鍍廢水中含有其他雜質和抑制因子，對菌株的代謝途徑產生了抑制作用。

2.3.2 有機磷。

從圖10可以看出，Micrococcus NT_1001能夠分解PC。當初始PC濃度小于20 g/L時，PC分解率隨著初始PC濃度增加而顯著增加;而當初始PC濃度大于20 g/L時，PC分解率降低。這表明PC對Micrococcus NT_1001可能存在底物抑制作用。最佳初始PC濃度為20 g/L。

在Micrococcus NT_1001降解PC的代謝產物中檢測出GPC。GPC是一種重要的神經遞質和磷脂前體，具有較高的市場價值。考察了不同初始PC條件下，Micrococcus NT_1001的GPC產量（圖11）。

從圖11可以看出，在初始PC濃度低于20 g/L時，GPC產量隨底物PC濃度增加而增加;當初始PC濃度大于20 g/L時，GPC產量降低。這一結果與圖9中PC的分解率變化趨勢一致。同時，通過計算不同條件下GPC收率，得到初始PC濃度對GPC收率的影響（圖12）。

從圖12可以看出，當初始PC濃度超過10 g/L時，GPC收率明顯降低。這表明Micrococcus NT_1001在PC濃度達10 g/L時，就已經受到底物抑制作用。當初始PC濃度為10 g/L時，GPC收率為1.33%。

3 討論與結論

磷元素是生物體所需的重要營養元素之一，也是原生質的重要組分之一。高能磷酸鍵同時也是微生物所需能量的載體。因此，包括微生物在內的生物細胞體內生化過程正常進行都必須有磷元素的加入和作用。該文首次從我國傳統白酒釀造工藝中取樣，富集、篩選和分離出了一株高效的解磷微生物Micrococcus NT_1001，分析了其培養條件和對無機磷、有機磷原料的分解和轉化性能，初步優化了其生產附加值高的GPC產品的條件。但是，Micrococcus NT_1001在分解和轉化中的作用機制尚不明確，且Micrococcus NT_1001在其他生理生化過程中產生的作用和功效仍需要進行深入研究和挖掘。

從湯溝酒廠酒醅中篩選出一株具有良好解磷性能的微球菌，命名為Micrococcus NT_1001，該菌株在37 ℃和pH 8.0條件下的菌體生長量最高。同時，考察了Micrococcus NT_1001對無機磷KH2PO4和有機磷PC的降解性能。當初始KH2PO4濃度為60 mg/L時，Micrococcus NT_1001對KH2PO4的分解率最高;當初始PC濃度為10 g/L時，GPC收率最高。

盡管如此，無機磷和有機磷都對Micrococcus NT_1001具有底物抑制作用。

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