除磷微生物固定化處理工藝的優化

張雅婷　熊慧　羊晨　梁國輝　魏寶陽　李立恒

摘要 為了有效去除污染水體中磷含量，采用吸附劑結合聚乙烯醇（PVA）和海藻酸鈉（SA）作為復合載體固定化除磷微生物。通過研究固定化小球的成球效果、機械強度和傳質性能，確定了聚乙烯醇（PVA）和海藻酸鈉（SA）的最佳濃度配比為10%聚乙烯醇和0.5%海藻酸鈉。比較不同復合固定化微生物載體的物理參數，確定以除磷樹脂作為吸附劑時除磷效果最佳。對制備的固定化微生物進行不同理化條件的廢水模擬，確定最適除磷條件為25 ℃左右、pH中性、轉速160 r/min，處理72 h后，除磷率可達80%左右。

關鍵詞 除磷微生物;固定化載體;地衣芽孢桿菌;固定化條件優化

中圖分類號 X703文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2020）13-0093-03

Abstract In order to effectively remove the phosphorus content in the polluted water， the adsorbent is combined with polyvinyl alcohol （PVA） and sodium alginate （SA） as a composite carrier to immobilize the phosphorus removal microorganisms.By studying the ball formation effect， mechanical strength and mass transfer performance of the immobilized pellets， the optimal concentration ratio of polyvinyl alcohol （PVA） and sodium alginate （SA） was determined to be 10% polyvinyl alcohol and 0.5% sodium alginate.The physical parameters of different composite immobilized microbial carriers were compared to determine the best phosphorus removal effect when phosphorus removal resin was used as adsorbent.The immobilized microorganisms were prepared to simulate wastewater with different physical and chemical conditions， and the optimal phosphorus removal conditions were determined to be about 25 ℃， pH neutral， and speed 160 r/min. After 72 hours of treatment， the phosphorus removal rate could reach 80%.

Key words Dephosphorization microorganisms;Immobilized carrier;Bacillus licheniformis;Optimization of immobilization conditions

由于人口劇增、環境污染等問題[1-2]，大量氮、磷有機物隨著廢水注入江河湖海，氮、磷含量超標是致使水體富營養化[3-8]的主要原因。因此，研究污水處理技術來改善水生生態環境質量就顯得十分重要[9-10]。

微生物固定化技術作為一種高效率低能耗技術，現成為國內外廢水處理領域的研究熱點[11-12]。固定化微生物修復技術具有以下特點：①微生物細胞固定時，可有效避免人為破壞生物酶活性以及生化反應的穩定性;②可以提高單位體積水體內的微生物密度;③固定化后的微生物能長期保持活性，在復雜環境條件下也能穩定地發揮高效性能，且可重復使用[13-14]。因此采用微生物固定化技術能在保證微生物作用情況下，回收固定化微生物，既經濟又環保[15]。常見的固定化方法有吸附法、包埋法和交聯法[16-17]，現多采用包埋法與交聯法相結合[18-22]。該研究利用“除磷吸附劑-包埋-交聯”相結合的復合固定化方法固定高效除磷菌，提高廢水除磷能力，并有利于磷的回收，目前鮮見文獻報道采用該方法進行高磷廢水處理。

湖南農業大學生物科學技術學院微生物研究實驗室前期篩選獲得一株高效除磷地衣芽孢桿菌S21（Bacillus licheniformis），為了將其應用于水體時獲得更穩定、高效的作用效果，該研究分析聚乙烯醇（PVA）和海藻酸鈉（SA）的最佳濃度配比和不同吸附劑對固定化小球性能的影響[23]，篩選合適的固定化載體，以擴寬其應用范圍[24-26];并對固定化微生物進行不同條件的廢水模擬，得知該固定化微生物的最適除磷條件，為廢水處理的工業化應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株S21篩選自湖南省長沙市芙蓉區瀏陽河農業大學校醫院邊湖畔的湖水底泥。

除磷樹脂、活性炭、新型除磷材料，藍深科技有限公司;聚乙烯醇、海藻酸鈉、硼酸、亞甲基藍、氯化鈣、氯化鈉，國藥集團化學試劑有限公司;廢水模擬培養基：乙酸鈉0.249 g、牛肉膏0.113 g、（NH4）2SO4 0.111 g、MgSO4·7H2O 0.205 g、FeSO4·7H2O 0001 g，蒸餾水500 mL，KH2PO4 0.020 g;發酵培養基：蛋白胨水培養基1 L，1.6%漠甲酷紫乙醇溶液1～2 mL，pH 7.6，121 ℃滅菌20 min。另配20%糖溶液（葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉），115 ℃濕熱滅菌30 min。

1.2 儀器與設備

TMP-510電子天平，湘儀天平儀器設備有限公司;BCD-286H冰箱，海爾集團;MJ-160C細菌培養箱，上海博訊實業有限公司;SS-325高壓滅菌鍋，TOMY.KOGYO.Co.Ltd.;722型可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司;SW-CJ-1B（U）單人單面超凈工作臺，蘇州設備凈化有限公司;立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊實業有限公司醫療設備廠;CR21G高速冷凍離心機，無錫凱派克斯科技有限公司;KG2C-1128電磁爐，康佳集團股份有限公司;恒溫搖床，天津市歐諾儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 固定化微生物載體制備方法。

根據文獻參考[23，25-28]，選擇聚乙烯醇（PVA）和海藻酸鈉（SA）的混合載體作固定化載體。聚乙烯醇（5%、7%、10%、13%）和海藻酸鈉（0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%）按不同比例搭配，90 ℃加熱并攪拌溶解，冷卻至40 ℃制得混合膠體。用5 mL注射器向4%CaCl2飽和硼酸溶液（pH=6.7）逐滴滴加混合液，邊滴邊攪拌。交聯24 h后，取出固定化小球，用蒸餾水和生理鹽水沖洗3次，存放備用。

1.3.2 固定化微生物載體性能測定方法。

1.3.2.1 密度和直徑的測定。電子天平稱重量筒m1，將固定化小球倒入量筒稱重m2，得到固定化小球重量m2-m1。倒入一定質量的蒸餾水且沒過固定化小球，量得體積V，得到固定化小球體積V-V水，得到固定化小球密度ρ=（m2-m1）/（V-V水）。隨機選取15個大小均勻的固定化小球，用游標卡尺測其直徑，計算平均直徑得固定化小球直徑。

1.3.2.2 傳質性能的測定。在50 mL蒸餾水中加入2滴亞甲基藍溶液，以蒸餾水作為對照，在600 nm處測得亞甲基藍溶液的OD值。然后加入30顆大小形態一致固定化小球，24 h后取出固定化小球，測定亞甲基藍溶液的吸光度。通過放入固定化小球前后亞甲基藍溶液的吸光度比較，可反映固定化小球的傳質性能。

1.3.2.3 膨脹率的測定。從各組試驗中取出等量固定化小球，用游標卡尺測出活化前直徑，將其分別置于盛有100 mL活化液錐形瓶中，常溫靜置培養6 h，再測出活化后的小球直徑，測得的小球平均直徑與原小球平均直徑之比即膨脹率。

1.3.2.4 機械強度的測定。從各組試驗中取出等量的固定化小球分別置于存有20顆玻璃珠和100 mL活化液的錐形瓶中，160 r/min、振蕩24 h后取出，計算完好顆粒與最初顆粒的比值，即固定化細胞的機械穩定性。每組3個平行，取平均值。

1.3.2.5 除磷率的測定。將固定化新型除磷材料分為包菌和不包菌2組，活性碳、除磷樹脂進行同樣處理，放入配制好的模擬廢水培養基中，72 h后測其磷含量，計算除磷率。

1.3.3 固定化微生物廢水模擬最適條件的方法。

1.3.3.1 最適溫度。取30粒包菌量5%的固定化小球，投放于100 mL滅菌的實際廢水中，設置溫度梯度為15、25、35、45 ℃，于160 r/min、pH 7，培養72 h，測其除磷率。

1.3.3.2 最適pH。取30粒包菌量5%的固定化小球，投放于100 mL滅菌的實際廢水中，設置pH梯度為3、5、7、9，于160 r/min、最適溫度，培養72 h，測其除磷率。

1.3.3.3 最適轉速。取30粒包菌量5%的固定化微生物，投放于100 mL滅菌的實際廢水中，設置搖床轉速梯度為0、80、160、240 r/min，于最適pH、最適溫度，培養72 h，測其除磷率。

1.3.3.4 最適時間。取30粒包菌量5%的固定化微生物，投放于100 mL滅菌的實際廢水中，于最適pH、最適轉速、最適溫度培養，每隔12、24、36、48、60、72、84、96、108 h測其除磷率。

2 結果與分析

2.1 固定化微生物載體制備

聚乙烯醇（PVA）和海藻酸鈉（SA）按不同的比例制備固定化小球，對比其物理性能，確定最佳組合比例。結果如表1，由于聚乙烯醇濃度過高時，膠體黏度較高，不易成球，推針筒時感到吃力，并伴隨嚴重的拖尾現象，使得固定化小球團聚。而當海藻酸鈉濃度過低時，小球成球率不高，容易形成拖尾團聚現象。因此，聚乙烯醇的合理濃度在8%～10%，海藻酸鈉的合理濃度在0.3%～05%，這種組合的小球僅少量破碎，大部分都未出現上浮和破碎現象，并且固定化小球能夠穩定和長期運行。綜合考慮表1，10%聚乙烯醇和0.5%海藻酸鈉混合制備的固定化小球在成球效果、機械強度和傳質性的綜合表現最優。從經濟和處理效果兩方面考慮，確定此為固定化微生物的包埋載體的最佳配比。

2.2 固定化微生物載體性能測定

試驗分別測定了固定化微生物活性炭、新型除磷材料、吸附樹脂和固定化空白小球的載體性能，結果見表2。固定化小球的密度及直徑都比較均勻，其密度均比水重，說明固定化小球具有良好的沉降性能。對比空白球，由于吸附劑的加入在空間框架起支撐作用，從而提高了載體的空隙率和滲透率，載體內部生長的微生物與基質有充分的接觸機會和生長空間，因此復合固定化微生物的機械強度更高，具有更好的強度和穩定性。綜合比較，除磷樹脂作為吸附劑的固定化微生物除磷效果最好，選其應用于廢水條件模擬。

2.3 固定化微生物廢水模擬最適條件

2.3.1 溫度對固定化微生物廢水除磷的影響。

研究不同溫度對固定化S21除磷效果的影響，結果見表3。固定化微生物最適的除磷溫度在25～45 ℃，且高溫下仍可以繼續除磷，為處理工業高溫廢水提供了條件。推測在15 ℃以下的低溫環境下，除磷菌大部分失去了活性，生理代謝緩慢導致除磷效果差。

2.3.2 pH對固定化微生物廢水除磷的影響。

從不同pH對固定化S21除磷效果的影響（表4）可以看出，pH偏中性時固定化微生物廢水除磷效果最好，推測過酸過堿的條件破壞了微生物的生長進而導致除磷效果差。

2.3.3 轉速對固定化微生物廢水除磷的影響。

從表5可以看出，隨著轉速的增加，固定化小球的與污水接觸的比表面積增加，因此固定化微生物除磷效果增加，轉速為160 r/min時除磷率可達78%。而轉速過快可能會導致小球破裂，除磷效果降低。

2.3.4 處理時間對固定化微生物廢水除磷的影響。

從處理時間對固定化S21除磷效果的影響（表6）可以看出，在處理前24 h內除磷率較低，處理60 h后的除磷率都達到了70%以上，處理72 h后除磷率達80%左右。

3 結論

該研究以海藻酸鈉和聚乙烯醇為包埋載體，篩選除磷樹脂作為吸附載體制備復合載體固定化除磷菌。通過固定化載體的選擇試驗，得到以10%聚乙烯醇+05%海藻酸鈉+05%除磷樹脂的比例混合制備的固定化微生物載體，在成球效果、機械強度、除磷率、傳質性的綜合表現最好。通過對固定化微生物實際廢水除磷理化性質研究，確定固定化微生物最適除磷溫度為25 ℃、最佳轉速為160 r/min，最佳除磷酸堿度為中性，在除磷處理72 h后，除磷率可達80%左右。

該研究系統地探索了固定化工藝，對除磷菌的固定化進行了初步研究，但研究水平還只是停留在實驗室水平，要實現固定化微生物技術的工業化，將其投入現實污水處理工程，還需要結合現有廢水處理工藝，開發新型工藝技術。

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