古籍書庫空氣真菌種屬調查

任珊珊

（國家圖書館，北京 100081）

空氣微生物廣泛存在于環境中，主要包括細菌、真菌、病毒等生命體，其中已發現的真菌有4萬余種，主要粒徑分布在3～100μm[1]。它們的存在不僅威脅人類健康，更會對古籍、檔案和文物等造成不可逆轉的損壞。近年來，針對空氣中真菌的研究已經成為圖書館、檔案和文博行業的基礎研究內容之一。故宮博物院采用平皿沉降法在各個庫房采樣，其中書畫組存放的東西司庫等8個庫房主要有枝孢霉，黃曲霉等霉菌[2]。三峽博物館文物庫房中空氣真菌主要種屬為曲霉屬（70%）和青霉屬（13%）[3]。放線菌、枝孢屬、青霉屬和鏈格孢屬等大量存在于魏晉五號壁畫墓的墓室空氣中，成為威脅磚壁畫保存的重要污染源[4]。中國農業大學圖書館空氣中霉菌主要為青霉屬和曲霉屬[5]。

1 材料與方法

1.1 實驗設備與試劑

北京明杰藍天FA-1六級篩孔式空氣微生物采樣器，德國MEMMERT IPP200培養箱，上海博迅YXQ-LS-100G立式壓力蒸汽滅菌器，蘇州凈化SW-CJ-2FD雙人超凈臺，太倉強樂THZ-C型空氣恒溫振蕩器，德國SIGMA 3-30k離心機，日本Nikon 90i顯微鏡，美國Bio-Rad MyCylerPCR儀，北京六一DYY-6C電泳儀電源，上海精科WFH-201B紫外透射反射儀和四川優普UPT-30L純水機等。

瓊脂糖、瓊脂、葡萄糖、Tris-硼酸和無水乙醇等（國藥試劑）；上樣緩沖液、DNA ladder和GoldView核酸染色劑（Solarbio）；乳酸酚棉藍染色劑（青島海博）；Taq聚合酶（Apexbio）；通用型基因組提取試劑盒、為世紀瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（康為世紀）等。

1.2 樣品采集方法

2019年4月在國家圖書館古籍書庫進行采樣。書庫配備有恒溫恒濕空調機組，用于控制書庫內的溫度和相對濕度。采樣期間，書庫溫度為24℃，相對濕度為48%。采用撞擊式采樣法，參數設置為采樣速度28.3L/min，采樣2.5min。采樣時使用PDA培養基。培養基倒置放入生物培養箱。培養條件為28℃±1℃，培養 7d。

1.3 形態學分析方法

平板點植接種培養，每皿三點。新接種的培養基倒置于生物培養箱中，28℃±1℃，培養7d。培養結束后記錄菌落形態。取小塊真菌培養物置于載玻片，乳酸酚棉藍染色法染色后置于顯微鏡下觀察真菌菌絲和孢子的形態特征。

1.4 分子鑒定方法

提取樣品總DNA。使用通用型基因組DNA提取試劑盒，根據操作說明提取篩選出的真菌基因組DNA。提取后的DNA于-80℃保存備用。

目標片段擴增（PCR）。使用真菌ITS PCR通用引物。ITS1:5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’；ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。配置PCR 反應體系。2XTaq-pcr MIX：25μL；ITS1(10μM)：2μL；ITS4(10μM)：2μL； 基因組 DNA：2μL；ddH2O：19μL， 總計50μL。反應程序為：95℃預變性5min；94℃變性 30s；55℃退火 30s；72℃延伸 1min；設定儀器后開始PCR擴增試驗，循環35次；72℃延伸10min。獲得PCR產物。

目標片段的確定與回收。取PCR產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳試驗，待DNA Marker各條帶跑開顯示清晰后，結束電泳。紫外燈下觀察凝膠中的DNA條帶，并切出含有目標DNA的凝膠。根據回收試劑盒提供的方法進行DNA回收。

基因測序及序列分析。將回收產物送至北京睿博興科公司進行測序。利用BLAST方式將測序所得序列在GenBank數據庫中進行比對，獲得和測序DNA序列同源性最高的真菌ITS序列，確認樣品的種屬信息。

2 結果與分析

采集得到的樣品根據形態特征可歸類為5種真菌，分別編號為 F-01、F-02、F-03、F-04 和 F-05。對它們進行純化培養，觀察其菌落及菌體形態，并進行后續的分子鑒定工作。

2.1 優勢真菌的形態學觀察

將選出的5種真菌進行點種純化培養7d后，觀察其真菌菌落形態，可發現不同真菌產生的色素各不相同，菌落質地也有很大區別，具體特征見表1。

表1 真菌菌落形態特征

用乳酸酚棉藍染色法挑菌制片，鏡檢觀察真菌菌體形態，放大倍數均為400×，結果如圖1所示。可以看出：F-01菌絲分隔，分生孢子梗較短，分生孢子呈棒狀；F-02菌絲不分隔，分生孢子梗較長。分生孢子球形或橢圓形；F-03菌絲分隔，孢子呈卵圓形；F-04細胞個體為圓形或卵圓形，有明顯的壓制現象；F-05分生孢子頭近球形，小梗雙層，放射狀排列，頂端有鏈形孢子。

圖1 真菌顯微形態特征

2.2 優勢真菌的分子鑒定

提取5種優勢真菌的基因組DNA，利用真菌ITS PCR擴增通用引物對基因組DNA進行PCR擴增，得到目標基因，即真菌ITS基因。瓊脂糖凝膠電泳確認后回收DNA，結果如圖2所示。將獲得的產物測序后，得到其序列信息。在GenBank中比對得到同源性最高的DNA片段的GenBank登錄號，確定優勢真菌的種屬信息，見表2。得到結果：古籍書庫空氣中的優勢真菌有鏈格孢屬的極細鏈格孢霉，擬青霉屬的擬青霉SL95，枝孢霉屬的枝孢樣枝孢霉，隱球酵母屬的大隱球酵母和曲霉屬的雜色曲霉。

圖2 優勢真菌ITS基因凝膠電泳

表2 菌種鑒定信息

3 討論

在古籍書庫中進行空氣真菌采樣，篩選出5種優勢真菌，結合形態學和分子鑒定結果，發現這五種真菌分別為鏈格孢屬的極細鏈格孢霉，擬青霉屬的擬青霉SL95，枝孢霉屬的枝孢樣枝孢霉，隱球酵母屬的大隱球酵母和曲霉屬的雜色曲霉。這與2013年所作調查北京市居家環境空氣中主要真菌種類青霉屬、枝孢屬、曲霉屬、鏈格孢屬和莖點霉屬接近[6]。本次研究明確了古籍書庫中優勢空氣真菌種類，可為書庫的日常有害生物預防和真菌爆發性增長時的治理提供必要的技術支持。