對在注射劑研發過程中無菌檢查的思考

徐興魯 邢立超 王少鵬 王 丹

山東新創生物科技有限公司 山東 濟南250000

注射劑系指藥物制成的供注入體內的無菌溶液以及供臨用前配成溶液或混懸液的無菌粉末或濃溶液，作為藥品的一種重要劑型被廣泛地應用于臨床，由于其直接注入人體體內，發揮療效，因此其安全性顯得更為重要。無菌檢查是體現滅菌效果的主要手段，也是注射劑質量控制的一個重要指標。

無菌檢查法一般分為兩種方法：直接接種法和薄膜過濾法。直接接種法即每支(或瓶)供試品按規定量分別接入含培養細菌及真菌培養基的容器中。薄膜過濾法應優先采用封閉式薄膜過濾器，也可用一般薄膜過濾器。無菌檢查用的濾膜孔徑為0.45μm，直徑約為50 mm。根據供試品及溶劑的特性選擇濾膜的材質。如抑菌性供試品采用具有疏水性邊緣及低吸附性的濾膜。濾器及濾膜采用適宜的方法滅菌；使用時，要保證濾膜的完整性；水溶性供試品，先用少量沖洗液濕潤濾膜。油類供試品，濾膜和濾器，在使用前應充分干燥，備用。過濾時，保持供試液及沖洗液覆蓋整個濾膜表面；沖洗濾膜時，每張濾膜每次沖洗量為100 ml，沖洗液、沖洗量及沖洗方法與方法驗證相同。

方法驗證：1.薄膜過濾法是將規定量的供試品按薄膜過濾法過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入小于100 cfu的試驗菌。取出濾膜接種至相應的培養基中，或將培養基加至濾筒內。取一支裝有同體積培養基的容器，加入等量的試驗菌，作為陽性對照，按規定溫度培養3～5天。各試驗菌同法操作。2.直接接種法是指取符合直接接種法培養基用量要求的硫乙醇酸鹽流體培養基8支，分別接入金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌的菌懸液1 ml(含菌小于100 cfu)各兩管；取符合直接接種法培養基用量要求的改良馬丁培養基4管，分別接入白色念珠菌、黑曲霉菌的菌懸液1ml(含菌小于100 cfu)各兩管。其中1管接入規定量的供試品，另1管作為陽性對照，按規定的溫度培養3～5天。與陽性對照比較，如含供試品各容器中的試驗菌均生長良好，則供試品的該檢驗量在該檢驗條件下無抑菌作用，可按此法進行供試品的無菌檢查。如含供試品的任一容器中微生物生長微弱、緩慢或不生長，則供試品的該檢驗量在該檢驗條件下有抑菌作用，可采用增加沖洗量，增加培養基的用量，使用中和劑如β-內酰胺酶、對氨基苯甲酸、聚山梨脂80等，更換濾膜品種等方法消除供試品的抑菌作用，并重新進行驗證試驗。

下面談一下在藥物研發過程中遇到問題的思考：

1.樣品取樣量方面：檢驗數量是指一次檢驗所用供試品最小包裝容器的數量；檢驗量是指一次試驗所用的供試品總量。檢驗量的表格不包括陽性對照用的用量，雖然有專門說明，但仍容易忽略。無菌檢查應保證檢驗數量以使試驗結果具有代表性；而陽性對照和驗證試驗滿足檢驗量總量要求即可以檢驗樣品對試驗結果的影響，即保證實驗結果的可靠性。

2.樣品處理方面：注射劑有不同劑型，對于注射液還比較好過濾，但對于其他劑型要注意處理方式。如粉針劑，要關注固體樣品的溶解、轉移、均勻分配問題，通常將規定取樣量全部轉移到500 ml稀釋劑或適宜溶液中，再進行分配。在對可溶于十四烷酸異丙酯的油類供試品進行處理時，無菌的十四烷酸異丙酯用量需經方法學驗證。3.培養基與菌種方面：做無菌實驗前進行培養基的適用性檢查是很有必要的，培養基的適用性檢查包括培養基的無菌性檢查和培養基的靈敏度檢查，以確保初步環節可靠。驗證用菌株為金黃色葡萄球菌、銅綠色假單胞菌、枯草桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉，中檢所老師要求應加上大腸埃希菌，一共七株菌，對每一試驗菌應逐一進行驗證；由于使用頻繁，對菌種的要求為不得超過5代，采用適宜的方法保存；加菌量應小于100cfu，一般100cf u比較合適，過多過少均影響判斷結果。有的申報資料中未提供試驗菌的濃度，這一點往往被忽視。4.操作方法方面：直接接種法取樣量少，方法繁瑣，且易受外源性細菌污染，對操作者和操作環境要求高，對實驗結果的影響較大。薄膜過濾法采用大取樣量集菌的方法，具有代表性，不易漏檢，儀器操作簡單。該系統是全封閉過濾系統，避免了操作過程中外源性細菌的污染，對實驗結果的可信性影響較小。取樣量大于5 ml/支直接接種法不再適用，發展趨勢采用全封閉的薄膜過濾法。

5.快速無菌檢查法：開展快速無菌檢測技術研究的意義在于，傳統無菌試驗至少耗時14天，對有效期短的產品，如體細胞治療產品、基因治療產品等，以及生產過程中間產品、原液及半成品快速的使用，縮短生產周期，在較短的時間之內放行和使用。