熱輔助超聲波對渾濁小麥啤酒理化和感官特性的影響

肖 秧，樸美子，鄧 陽*

（青島農業大學食品科學與工程學院，山東 青島 266109）

啤酒是一種深受人們喜愛的低酒精含量且營養豐富的飲料。在啤酒釀造行業，小麥以及小麥芽常被用作輔料[1]。小麥啤酒是典型的上面發酵（Ale）啤酒，原料由大麥芽和發芽或未發芽的小麥組成，并且小麥或小麥芽所占的比例至少達到谷物總量的40%[2-3]。小麥啤酒具有獨特且細膩的泡沫，呈現出類似香蕉的水果香和類似丁香花的香氣，口感飽滿，苦感較弱。這使小麥啤酒在過去的幾十年里越來越受到消費者喜愛。此外，強烈且穩定存在的膠體渾濁也是小麥啤酒另一個至關重要的產品特性。Delvaux等[2]發現，與皮爾森啤酒相似，小麥啤酒中的膠體渾濁顆粒也主要是由蛋白質與多酚、淀粉或淀粉降解物結合形成的復合物。事實上，現在普遍認為小麥面筋蛋白具有渾濁活性，可與多酚結合形成渾濁顆粒[2,4]。另外，糖化過程的蛋白質水解可產生更小的渾濁顆粒，因此更有利于膠體渾濁的穩定性[4]。

目前，啤酒生產多采用傳統的隧道式巴氏熱處理來進行殺菌，長時間的加熱處理容易導致啤酒的質量下降[5]。因此，更高的營養和感官品質的消費需求促使了新的啤酒非熱加工技術的研發。超聲波技術由于具有操作簡便一致、環保安全的特點，受到人們的特別青睞。超聲波技術在食品加工、巴氏殺菌和萃取領域被認為是一種可持續的“綠色和創新”技術，能夠降低水和溶劑的消耗以及有害物質的產生，消除廢水后處理過程，減少不可再生能源的損耗[6-7]。超聲波技術是通過在20～100 kHz的頻率范圍內傳播聲波，在幾秒到幾分鐘內使能量傳遞到流體樣本中[6]。這些超聲波產生了壓縮和稀疏的交替區域，導致隨后的微觀空化氣泡坍塌。超聲波技術在啤酒加工和貯存方面應用前景廣闊，如提高產品產量，縮短加工時間，降低操作和維護成本，改善口感、風味和顏色，減少低溫致病菌等[6,8-9]。目前，超聲波技術已應用于實驗室規模的啤酒生產中，它能夠提高麥汁糖化效率，從而將發酵過程加速36%～50%，最終提高啤酒的產量；又能應用于啤酒裝瓶前，達到除霧的效果[8-9]。這是因為超聲波提高了微生物細胞生長所需的氧氣和營養物質的轉運速率，使細胞內積累的代謝廢物更快地釋放到體外，從而加快了微生物的生長速率，提高了啤酒發酵的工藝效率。一般來說，室溫下超聲波處理會導致微生物和酶的失活，尤其是在低聲功率密度下[10-14]。熱輔助超聲波（thermosonication，TS）是一種聲熱結合技術，即在超聲波處理的同時輔助適當的熱處理，一般在食品中應用時熱處理溫度不超過60 ℃[6-9]。已有文獻表明，相比單獨使用相同溫度熱處理或相同條件超聲波處理，熱-超聲波聯合處理的殺菌和鈍酶效果更好[10-11]。Milani等[10]介紹了TS技術在啤酒巴氏殺菌中的首次應用。當用TS（50 ℃、10.8 W/mL、24 kHz）處理1.9 min時，微生物致死率大大提高。與傳統的熱處理相比，TS處理可以顯著降低常規熱處理的強度以實現啤酒微生物穩定性，同時改善啤酒質量[6,10]。Milani等[10]研究了熱處理和功率超聲的組合，降低了熱處理溫度和酵母子囊孢子滅活的處理時間。但目前關于超聲波或TS對小麥啤酒質量參數影響的研究較少。

雖然對于大多數的下面發酵（Lager）啤酒和Ale啤酒而言，渾濁都是不可接受的，但均勻、強烈且穩定的膠體渾濁毫無疑問是衡量小麥啤酒的重要標準。因此，TS技術可能是一項有效提高小麥啤酒渾濁強度及其穩定性的方法。本實驗的目的在于比較TS和傳統的熱處理兩種方式對小麥啤酒理化和感官特性的影響。評價產品質量的屬性包括微生物、色度、風味和泡沫穩定性，尤其是貯存期內膠體渾濁穩定性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

麥芽 永順泰麥芽有限公司；酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養基、平板計數瓊脂（plate count agar，PCA）培養基、de Man, Rogosa and Sharpe（MRS）培養基 德國Merck公司；4-乙烯基愈創木酚（4-hydroxy-3-methoxystyrene，4-VG）、4-乙烯基苯酚（4-vinylphenol，4-VP） 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

紫外-可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；CX-400 Vibra細胞超聲處理器 美國Sonics and Materials公司；高效液相色譜儀 日本島津公司；濁度儀、NIBEM檢測儀 荷蘭Haffmans公司；Zetasizer Nano ZS粒度分析儀 美國馬爾文公司。

1.3 方法

1.3.1 小麥啤酒樣品的制備

本實驗所使用到的小麥啤酒產自青島農業大學教學實訓中心，是由質量比為3∶2的大麥芽和小麥芽作為原料釀制而成。由于未經過濾工序，啤酒樣品呈現朦朧的霧狀，尤其富含懸浮物。均勻的渾濁小麥啤酒是用200 mL的聚對苯二甲酸乙二醇酯（polyethylene terephthalate，PET）滅菌瓶直接取自清酒罐，旋蓋蓋緊，并保證最少的頂空空氣。采樣后將小麥啤酒樣品存放于4 ℃黑暗條件下，并于24 h內進行TS或者熱處理。

1.3.2 熱輔助超聲處理

將200 mL小麥啤酒樣品置于VCX-400 Vibra細胞超聲處理器的250 mL玻璃雙壁配備冷卻夾套的容器中，使用24 kHz超聲探頭（直徑為22 mm）在50 ℃下分別超聲處理。參考Milani等[10]所述的TS實驗（50 ℃處理1.9 min），本實驗采用TS處理時間分別為1、2、3 min（開、關脈沖持續時間分別為4 s和2 s）。通過將超聲探頭的橫截面面積（1.539 cm2）與14 mm探頭的超聲強度（350 W/cm2，見產品說明書）相乘，計算538.7 W的超聲功率。因此，啤酒樣品的所供應的單位體積功率約為2.7 W/mL。所有的TS處理都在黑暗條件下進行，以避免光線對樣品的影響。采用循環水流式水浴使樣品的溫度保持恒定。在Milani等[10]的TS實驗中，采用密閉容器防止CO2損失和揮發性風味化合物的蒸發。啤酒樣品經TS處理后，立即在無菌條件下轉移到標準尺寸的長頸瓶（高28.3 cm、寬7.3 cm）中。將瓶頂空間用CO2以120 mL/min的流速沖洗約3 min以除去空氣。然后用金屬蓋緊緊地蓋住瓶子以便進一步分析。所有TS處理樣品設3 個平行，然后將3 批樣品在相同條件（20 ℃）下在黑暗恒溫室中貯存。

1.3.3 熱殺菌處理

將小麥啤酒樣品首先倒入600 mL標準尺寸長頸瓶（高28.3 cm、寬7.3 cm）中，隨后置于水浴搖床中，升溫至60 ℃進行熱殺菌持續處理15 min，以達到15巴氏殺菌單位（PU），最后冷卻至室溫。同時，處理時瓶子不斷被加熱攪拌，以提高傳熱性。

1.3.4 微生物分析

在貯存的第0、28、56、84天時分別對小麥啤酒樣品中的酵母菌、乳酸菌、醋酸菌進行計數。酵母的計數采用YPD培養基，醋酸菌采用常規PCA培養基，而乳酸菌則采用MRS培養基進行計數。本實驗中所有的培養基和準備方法均由德國Merck公司提供。用膜過濾計數進行微生物分析，50 mL啤酒樣品經0.45 μm膜過濾，濾后將膜置于培養皿內的培養基表面，于相應條件下貯存相應天數后進行計數，以菌落形成單位（colony-forming units,CFU）表示。每個實驗在不同取樣日進行兩次，結果為兩次實驗結果的平均值。

1.3.5 理化特性的測定

標準啤酒分析參考歐洲釀造協會的分析方法[15]進行。4-VG和4-VP的含量則采用高效液相色譜法來檢測，該方法的精度能達到0.001 mg/L[16]。

乙酸異戊酯、乙酸乙酯和苯乙醇質量濃度的測定則采用Dong Jianjun等[17]的方法。

膠體渾濁度（＜1 μm粒徑的顆粒）于20 ℃溫度條件下用荷蘭Haffmans濁度儀通過90度角散射光進行測定，正如Delvaux等[4]描述的其濁度值單位由EBC表示。

小麥啤酒樣品的膠體渾濁顆粒物粒徑分布采用美國馬爾文公司的Zetasizer Nano ZS粒度分析儀進行測定，其中溫度為25 ℃，散射角為90°，測量范圍為0.3～10 μm。動態光散射是通過測量由顆粒粒子的布朗運動引起的光散射強度的動態波動來反映顆粒尺寸分布[18]。啤酒溶劑黏度為1.500 cP，介質折射率為1.330。

此外，采用NIBEM檢測儀測定啤酒樣品的泡沫穩定性，得到的NIBEM法分析值是泡沫下降3 cm所需要的時間，此測量對同一批次啤酒樣品有很高的重現性，平均差值為5.8 s（范圍為1.0～8.1 s）。

1.3.6 感官品評

啤酒感官評價是由8 名來自青島啤酒股份有限公司的專業啤酒評委來完成，包括年齡介于30～55 歲的3 名男性和5 名女性成員。對經TS和熱處理的小麥啤酒隨機進行感官品評分析。本輪品評總共5 個小麥啤酒樣品，包括未經任何處理的對照樣品、熱殺菌樣品（60 ℃、10 min）和TS樣品（50 ℃，2.7 W/mL分別處理1、2、3 min），各個樣品隨機排序，評委們參照美國釀造化學家協會的小麥啤酒專業品評方法進行品鑒[19]。感官品評分析以量化選定的與香氣和味道相關的感官屬性，并以1～5的強度來打分。其中1表示強度最弱，而5表示最強。感官屬性如下：總得分、丁香花味（主要來自4-VG和4-VP）、類似香蕉的水果香（主要來自苯乙醇）、苦感、酸感、甜感、新鮮度和飽滿度。

1.3.7 貯存期內濁度的測定

常規熱殺菌、TS以及未經任何處理的小麥啤酒樣品于20 ℃條件下避光貯存，并分別在第0、7、14、28、42、56、70、84天取出對渾濁穩定性進行相關分析。每次取樣都開啟一個新瓶樣品。

1.4 數據處理

實驗均設2 次重復、3 個平行，結果以平均值±標準偏差表示，圖表由Origin 8.0軟件制作，并采用SPSS 17.0軟件Duncan法進行顯著性分析（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 TS和熱處理對小麥啤酒中微生物的影響

本實驗對未經處理以及經過TS和熱處理后的小麥啤酒中存活的總酵母菌、醋酸菌和乳酸菌的數量進行測定。如表1所示，新鮮未處理的小麥啤酒中分別有大約1.18、1.63、7.19（lg（CFU/mL））的醋酸菌、乳酸菌和酵母菌。TS分別處理1、2、3 min和熱處理（60 ℃、15 min）可完全殺滅小麥啤酒中的醋酸菌和乳酸菌。在20 ℃貯存84 d后，小麥啤酒樣品中仍未發現有乳酸菌和醋酸菌存在。同時，熱殺菌處理以及TS處理2 min和3 min均可使小麥啤酒中的酵母菌失活，而TS處理1 min只能將酵母數降至0.86（lg（CFU/mL））（P＞0.05）。超聲波處理時瞬態空泡不對稱內爆所產生的液體射流會對微生物細胞膜造成嚴重損傷，可導致嚴重的細胞膜損傷和細胞壁聚合物材料的裂解。同時，穩定的空化氣泡振動也可能產生微流動并產生高剪切應力，這會導致細胞膜損傷并導致微生物的失活[20]。McClements[21]也提出，當與其他技術如加熱結合使用時，使用超聲波滅活微生物是有效的。因此，在本實驗條件下的TS技術對正常生產得到的新鮮小麥啤酒處理2 min以上，即可完全殺滅其中的酵母菌、乳酸菌和醋酸菌，獲得常規巴氏殺菌（60 ℃、15 min）一樣的效果。

表1 TS和熱處理對小麥啤酒中微生物的影響Table 1 Effect of TS and heat treatments on microbial counts of wheat beer

2.2 TS和熱處理對小麥啤酒中理化特性指標的影響

表2 TS和熱處理對小麥啤酒中理化特性指標的影響Table 2 Effects of TS and heat treatments on chemical and physical attributes of wheat beer

如表2所示，本實驗通過對處理前后小麥啤酒樣品進行分析發現，無論是經TS處理還是傳統的熱處理，原麥汁濃度、乙醇體積分數、pH值、苦味值和黏度均無明顯變化（P＜0.05）。Buzrul等[22]報道，不同條件下的TS處理（不同壓力和受壓時間）對Ale和Lager啤酒的苦味值、乙醇體積分數、pH值和原麥汁濃度均沒有顯著影響。此外，熱處理會顯著增加啤酒色度，而TS處理后的樣品與未經處理的小麥啤酒相比變化不明顯。本實驗結果證實了之前報道[23-24]，這可能歸因于TS處理溫度較常規熱殺菌要低，美拉德反應速率相對要慢[5]。

眾所周知，苯乙醇、4-VG和4-VP是小麥啤酒中必不可少的特征香氣和風味組分。由表2可知，相比于TS處理，熱處理小麥啤酒中的苯乙醇含量增加更多，盡管這些增加并不顯著。與未經任何處理的對照酒相比，TS和熱處理的小麥啤酒4-VG和4-VP質量濃度沒有顯著的差異。此外，與對照和3 種TS樣品相比，熱處理后啤酒的乙酸異戊酯含量略有下降，而乙酸乙酯含量有所上升。但Chang等[25]研究發現，20 kHz超聲波處理的玉米酒中高級醇含量略有增加，乙酸乙酯含量減少。然而，超聲波對酒精飲料這些揮發性芳香化合物的影響和機制尚不清楚。超聲波能夠促進食品和植物中天然產物的提取[26]。這些研究表明，超聲在處理天然產物時，可以誘導一些化合物的降解[25-26]。聲空化是能量和物質的一種獨特相互作用，導致發生高能化學反應[27]。結果還表明，3 種TS處理樣品與未經處理的對照相比，有著更高的泡沫穩定性和膠體渾濁度。相反，熱處理則會導致泡沫穩定性和膠體渾濁度下降。在3 種條件下，TS處理2 min可獲得更高的泡沫穩定性和膠體渾濁度（表2）。基于此，最終選擇經此條件處理的小麥啤酒樣品進行后續感官品評和貯存期渾濁穩定性評價。與已有研究[22]結果相似，TS處理2 min對比傳統巴氏熱處理顯示出更高的膠體渾濁度，這可能是由于在熱輔助超聲波條件下蛋白質降解產生更多的疏水位點從而可與多酚形成更多的復合物[22-23]。

2.3 TS和熱處理對新鮮小麥啤酒顆粒粒徑分布的影響

表3 TS和熱處理對小麥啤酒顆粒粒徑分布的影響Table 3 Effects of TS and heat treatments on particle size fractions of wheat beer%

如表3和圖1所示，動態光散射分析表明，未經處理的對照小麥啤酒樣品中的膠體渾濁顆粒平均粒徑為951.8 nm。另外，熱處理后小麥啤酒渾濁顆粒粒徑顯著增加，可能是由于小顆粒相互聚集所致。相反，經TS處理2 min后的樣品中顆粒粒徑分布更加均勻，并略有下降，其平均直徑為806.6 nm。作者前期研究發現，小麥啤酒中粒徑介于200～1 000 nm的顆粒主要來自蛋白質與多酚形成的復合物，是膠體渾濁穩定性的主要貢獻者，而粒徑超過5 μm的顆粒主要由酵母組成[28]。當啤酒樣品經熱殺菌處理后，這些顆粒可能變得更大進而沉淀至瓶底，因此導致濁度降低。因此，合乎邏輯的假設是TS處理的樣品有可能具有更小和更為均一的顆粒粒徑分布（700～1 000 nm），從而形成更穩定的膠體渾濁。

圖1 小麥啤酒的顆粒粒徑分布分析結果Fig. 1 Particle size distribution of wheat beer

2.4 TS和熱處理小麥啤酒的感官品評

為了進一步探討TS處理對小麥啤酒品質的影響，不同處理的小麥啤酒樣品分別進行了感官品評。如圖2所示，結果表明所有的3 款小麥啤酒（未經處理、TS處理2 min、傳統熱處理）均具有明顯的由4-VG產生的丁香花味。然而，與其他樣品相比，經過熱處理的小麥啤酒的類似香蕉的水果香味變弱。水果香氣主要來源于總酯，尤其與乙酸異戊酯含量相關，這賦予了小麥啤酒的香蕉味[29]。這些品評結果與之前的理化檢測結果相吻合。此外，TS處理后小麥啤酒的飽滿性，即入口后的豐滿感和新鮮感有輕微地提高。因此與傳統熱殺菌結果相比，TS處理幾乎不影響小麥啤酒的原有風味和口感特征。

圖2 小麥啤酒感官品評結果Fig. 2 Sensory evaluation of wheat beer

2.5 TS和熱處理對小麥啤酒貯存期內渾濁穩定性變化

圖3 小麥啤酒貯存期內渾濁穩定性變化Fig. 3 Changes in colloidal haze intensity during storage of wheat beer

圖3 顯示對照以及TS處理2 min和熱處理的小麥啤酒在20 ℃條件下貯存過程中膠體渾濁的變化情況。未經處理和熱處理的樣品從貯存的第一天開始都表現出相似的顯著下降趨勢。當貯存到第70天時，無論是對照還是熱處理樣品的濁度均下降至5 EBC以下，整個下降過程幾乎保持一致。然而，TS處理后的小麥啤酒在整個貯存期間內一直保持相對高的濁度。直到第84天時，樣品濁度仍接近于20 EBC。這些結果都支持了之前的假設，即一定程度上小麥啤酒中較小且更均勻的顆粒有助于形成更為穩定的膠體渾濁。TS處理使啤酒中的蛋白質形成細小顆粒，大小足以產生可見的霧狀渾濁但又不會沉降至瓶底而在幾個月的貯存期內懸浮于瓶中。Asano等[30]發現，通過使用蛋白水解酶改變蛋白質結構組成更有利于膠體渾濁穩定，部分蛋白質的水解形成更小的渾濁顆粒，從而產生更穩定的膠體渾濁[5]。有研究還發現，通過增加蛋白質的降解程度，減少沉淀的形成和發生，可保證膠體渾濁的穩定性[4]。通過對貯存84 d后TS處理2 min的小麥啤酒樣品再次進行顆粒粒徑分布分析，發現趨于渾濁穩定的啤酒樣品中粒徑介于200～1 000 nm的顆粒占到了97.9%。因此，進一步驗證了2.3節的假設，即粒徑200～1 000 nm的顆粒是膠體渾濁穩定性的主要貢獻者。

3 結 論

本實驗比較了熱（50 ℃）和功率超聲的聯合即TS處理和60 ℃溫度單獨熱殺菌對小麥啤酒主要品質特性，尤其是貯存期內膠體渾濁穩定性的影響。小麥啤酒的主要特性，例如原麥汁濃度、乙醇體積分數、pH值和苦味值，幾乎不受TS和熱處理的影響。與TS處理相比，熱處理會略微改變小麥啤酒的特征香氣成分的含量。更重要的是，在熱和超聲波的共同作用下小麥啤酒有著比熱處理和未處理的對照更高的膠體渾濁穩定性和泡沫穩定性。因此，TS可能是一種非常有前途的，且不影響原有口味的條件下用于啤酒生產的非熱加工技術。