輻照對帶魚魚糜內源性轉谷氨酰胺酶及凝膠特性的影響

楊 镕，徐安琪，朱煜康，賈 茹，黃 濤，徐大倫，張進杰，楊文鴿*

（寧波大學食品與藥學學院，浙江省動物蛋白食品精深加工技術重點實驗室，浙江 寧波 315211）

轉谷氨酰胺酶（transglutaminase，TGase）廣泛存在于魚類中，其主要作用是催化肌原纖維蛋白中谷氨酰胺殘基的γ-酰胺基與賴氨酸殘基的?-氨基發生交聯作用，生成分子內或分子間?-(γ-Glu)-Lys非二硫共價鍵，促進蛋白網狀結構的形成[1-2]。熱誘導魚糜凝膠的形成包括凝膠化、凝膠劣化與凝膠熟化3 個階段，研究認為魚肉蛋白的凝膠化有賴于其內源性TGase介導的蛋白質非二硫共價鍵的交聯，形成的魚糜凝膠強度與TGase活力正相關[3-4]。Tsukamasa等[5]指出沙丁魚魚糜較高的凝膠強度與其內源性TGase活性較高、可以更好地促進蛋白發生交聯有關；Benjakul等[6-7]發現內源性TGase能誘導蛋白質交聯，在兩種大眼鯛魚糜的凝膠增強中起重要作用，而幾種TGase的激活劑和抑制劑對4 種熱帶魚類（大眼魚、梭魚、鰭鯛和大眼鯛）魚糜的非二硫鍵共價交聯及其凝膠形成能力產生影響?？梢婔~糜含有內源性TGase，其活性與魚糜凝膠品質密切相關。

電子束輻照是一種新型的食品加工技術，在食品保鮮、質量和安全控制、品質改進等領域應用廣泛，電子束輻照能引起蛋白構象的改變，導致蛋白變性、聚集或凝膠化，同時也能改變魚糜內源性酶的結構及其活性，從而影響魚糜凝膠的形成[8-9]。如Deng Siyao等[10]利用電子束輻照處理梅魚魚糜，發現5 kGy劑量可以顯著提高魚糜凝膠強度，這可能與輻照引起魚肉肌原纖維蛋白α-螺旋含量的下降有關；Malik等[11]研究發現輻照作用于向日葵蛋白，引起蛋白α-螺旋含量降低和β-折疊含量增加；顧可飛[12]發現電子束輻照能抑制液態多酚氧化酶的活性；羅華彬等[13]認為電子束輻照通過影響帶魚魚糜肌原纖維結合型絲氨酸蛋白酶和組織蛋白酶L的二級結構，抑制這兩種內源性蛋白酶活性，減輕對肌原纖維蛋白的降解作用，從而起到防止凝膠劣化、有利于形成高品質帶魚魚糜凝膠的作用。

帶魚魚糜所含內源性TGase也與帶魚魚糜凝膠化作用有關[14]。為進一步闡述電子束輻照對魚糜凝膠特性的影響機理，本實驗以0～9 kGy電子束輻照帶魚魚糜，提取魚糜中的內源性TGase，測定酶活力及其最適反應溫度和pH值，并通過傅里葉變換紅外光譜、圓二色光譜分析酶的二級結構，探究電子束輻照對帶魚魚糜TGase的影響機理，旨在為利用電子束輻照改進魚糜及其制品品質提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷凍帶魚魚糜購自寧波飛日水產實業有限公司，-20 ℃貯藏備用。

DL-二硫蘇糖醇（DL-dithiothreitol，DTT）、單丹磺酰尸胺（monodansylcadaverine，MDC） 美國Sigma公司；N,N-二甲基化酪蛋白 北京索萊寶公司；其余試劑均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

NBL-1020電子直線加速器 寧波超能科技股份有限公司；UMC 5型真空斬拌機 德國Stephan Machinery公司；Biofuge Stratos臺式高速冷凍離心機 德國Thermo Scientific SORVALL公司；SpectraMax i3多功能酶標儀 美國Molecular Devices公司；J-1500圓二色光譜儀 日本JASCO公司；FWT-60薄膜劑量計 美國遠西公司。

1.3 方法

1.3.1 魚糜輻照處理

冷凍帶魚魚糜，300 g/袋真空包裝。設置電子直線加速器能量為10 MeV，輻照劑量分別為0、1、3、5、7、9 kGy，采用FWT-60薄膜劑量計，通過分光光度法標定吸收劑量，該劑量計經中國計量科學院比對，劑量誤差小于±3%，其中以0 kGy為對照組。輻照時樣品整齊排列，設置3 個平行；輻照后冰藏保存樣品，并在2 h內進行TGase的提取和魚糜凝膠的制作。

1.3.2 TGase的提取及其活力的測定

TGase的提取及其活力的測定參照楊方[15]、Takagi[16]等的方法略作修改。取各組魚糜5 g，加入預冷的Tris-HCl緩沖液（0.1 mol/L pH 7.5、含10 mmol/L NaCl）15 mL，冰浴中緩慢攪拌30 min后離心（16 000×g、4 ℃、30 min），上清液用硫酸銨沉淀，冷凍離心10 min，沉淀用Tris-HCl緩沖液溶解，即為TGase酶液。將酶液放入透析袋中過夜，純化后冷凍干燥。

將凍干TGase粉末溶于蒸餾水中，制成TGase酶液。取2 mL酶液，加入2 mL反應液（含2 mg/mL N,N-二甲基化酪蛋白、5 mmol/L CaCl2、30 μmol/L MDC、3 mmol/L DTT、50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5），37 ℃下反應10 min，加入1 mol/L (NH4)2SO4溶液終止反應。酶標儀測定熒光強度，激發波長為350 nm，發射波長為480 nm，以每分鐘轉化1 μmol底物所需要的酶量為1 個活力單位（U）。

1.3.3 TGase最適反應溫度與最適反應pH值的測定

將反應體系溫度分別設置為0、25、35、40、45、55、65、75、85 ℃，其余按照1.3.2節方法測定TGase活力，確定輻照對TGase最適反應溫度的影響。將反應體系分別設置為不同pH值（4.0、5.0、6.0、7.0、7.5、8.0、9.0、10.0）的Tris緩沖液，其余按照1.3.2節方法測定TGase活力，確定輻照對TGase最適反應pH值的影響。

1.3.4 TGase的傅里葉變換紅外光譜分析

準確稱取干燥TGase樣品1.0 mg，與溴化鉀粉末以質量比1∶100混合均勻，壓片掃描（400～4 000 cm-1），采用Peakfit 4.12軟件計算TGase中各二級結構單元的相對含量。

1.3.5 TGase的圓二色光譜分析

參照Guan Aiyan等[8]的方法略作修改。采用圓二色光譜儀，選用光徑為1 mm的石英樣品池，在遠紫外區（190～250 nm）對0.2 mg/mL TGase溶液進行掃描，掃描速率為50 nm/min，響應時間0.25 s，以蒸餾水作空白。利用儀器自帶軟件楊氏模量程序計算各二級結構的相對含量。

1.3.6 魚糜凝膠強度和保水性的測定

樣品處理及凝膠強度測定參考鄧思瑤等[17]的方法。取各組帶魚魚糜，置于真空斬拌機中低溫空斬2 min，添加魚糜質量2.5%的食鹽繼續斬拌8 min。將斬拌后的魚糜溶膠灌入直徑2.5 cm、長約10 cm的腸衣，兩頭扎緊腸衣，再進行二段式加熱凝膠化（40 ℃加熱60 min后90 ℃高溫凝膠化30 min），冷卻得到魚糜凝膠，4 ℃放置12 h后進行凝膠強度和保水性分析。

將魚糜凝膠樣品切割為表面光滑、長度約2 cm的柱體備用。壓縮模式測凝膠強度（P0.5 s探頭），測前、測試、測后速率均為1.0 mm/s，壓縮比50%、10 g觸發力。

保水性參照文獻[18]方法測定。取待測凝膠樣品，切片（厚度0.2 cm）四等分，雙層濾紙包裹離心（3 000×g，10 min）。記離心管質量為m/g，離心前后離心管與樣品總質量分別為m1/g和m2/g，按下式計算保水性。

1.4 數據處理與分析

實驗設置3～6 個平行，數據以平均值±標準偏差表示，采用Origin 9.0軟件作圖，通過SPSS 19.0軟件方差分析法進行顯著性分析，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 電子束輻照對帶魚魚糜TGase活力的影響

圖1 電子束輻照對TGase活力的影響Fig. 1 Effect of EB irradiation on the activity of TGase

TGase有促進蛋白形成凝膠網狀結構、增強魚糜凝膠的硬度和彈性等作用，較高的TGase活性有利于魚糜凝膠的形成。由圖1可知，隨著輻照劑量的增加，魚糜內源性TGase活力先上升后下降，5 kGy組魚糜中的TGase活力最高，并顯著高于對照組及其他劑量處理組（P＜0.05），7 kGy和9 kGy組TGase活力低于對照組，尤其是9 kGy組TGase活力顯著降低。羅華彬等[13]發現電子束輻照處理會降低帶魚魚糜蛋白酶的活性，隨著輻照劑量的增加，內源性蛋白酶活性降低，當劑量為5 kGy及以上時下降程度更為顯著；顧可飛[12]發現當電子束輻照劑量為8.69 kGy時，液態多酚氧化酶的相對活力損失85%；趙菊鵬[19]發現不同劑量輻照桔小實蠅各齡幼蟲后，均不同程度誘導了羧酸酯酶的活性升高；鄭秀艷等[20]認為0.75～4.50 kGy輻照不會對脂肪氧化酶活性產生明顯影響；戴群等[21]對茶葉分別進行4、7、10 kGy和12 kGy輻照，發現4 kGy組過氧化物酶活力及4 、7 kGy和10 kGy組多酚氧化酶活力均高于對照組?？梢姡椪諏γ富钚缘挠绊懪c劑量及酶的種類有關，不同酶對輻照的敏感性不一。本實驗中，1、3 kGy和5 kGy劑量能激活TGase活性，其中5 kGy組效果最顯著，但7 kGy和9 kGy劑量則抑制TGase活性。原因在于輻照有可能影響蛋白結構，也能改變魚糜內源酶的空間構象。推測較低劑量輻照能促進TGase肽鏈的伸展，活性基團的適當暴露有利于酶催化肌原纖維蛋白中谷氨酰胺殘基的γ-酰胺基與賴氨酸殘基的?-氨基發生交聯，而隨著輻照劑量的繼續增加，TGase分子上暴露基團之間的相互作用增強，從而削弱了酶分子對底物的親和能力，導致酶活力下降。

2.2 電子束輻照對帶魚魚糜TGase最適反應溫度和pH值的影響

由表1可知，9 kGy組魚糜TGase的最適反應溫度為45 ℃，其余組均為40 ℃。在55～75 ℃區間內，各組魚糜TGase活力有所降低，而在85 ℃時TGase活力急劇下降。電子束輻照后魚糜內源性TGase對溫度的敏感性不同，25 ℃時對照組魚糜TGase活力最大，35 ℃和40 ℃時，1、3、5 kGy組魚糜TGase活力高于對照組，而在45 ℃條件下，對照組和5、7 kGy組魚糜TGase活力基本接近，并高于其余組。

表1 電子束輻照對不同溫度下TGase活力的影響Table 1 Effect of EB irradiation on the activity of TGase at different temperatures U/g

表2 電子束輻照對不同pH值下TGase活力的影響Table 2 Effect of EB irradiation on the activity of TGase at different pH levels U/g

由表2可以得出，各組帶魚魚糜內源性TGase的最適反應pH值在8.0左右，輻照處理沒有改變TGase的最適反應pH值。魚的種類及其生活的環境溫度會影響魚類內源性TGase的最適反應溫度和最適反應pH值。Worratao等[22]從羅非魚魚肉中分離得到TGase，測定其最適反應溫度為50 ℃，鳙魚內源性TGase的最適反應溫度約為40 ℃[23]，羅非魚和鳙魚TGase的最適反應pH值均為7.0～7.5，而紅金線魚、長尾大眼鯛、真鯛魚TGase的最適反應pH值分別為8.5～9.0、8.0、9.0～9.5[24-26]。本實驗中帶魚魚糜TGase的最適反應溫度和pH值與其他魚種也基本吻合。嚴菁[27]研究了TGase作用于鰱魚魚糜的最適反應溫度，認為在37 ℃時TGase具有較高的活力；孫靜靜[28]在TGase對草魚糜凝膠性的影響研究中認為，溫度保持在42 ℃有利于提高TGase活力，形成品質更好的魚糜凝膠。

和大多數酶一樣，pH值會影響酶分子上基團的解離，影響酶和底物分子的結合；高溫下酶和底物分子運動加快，碰撞機會增加，進而提高酶的催化活性，但高溫同時會引起酶分子變性失活。經電子束輻照處理，各組魚糜內源性TGase的活力隨著pH值或溫度的升高呈現先升高后下降趨勢，并均在pH 8.0、溫度40～45 ℃時活力達到最大，可見輻照處理影響魚糜內源性TGase的活性，但并沒有明顯改變TGase的最適反應pH值和最適反應溫度。在熱誘導魚糜凝膠形成的過程中，低溫段采取40 ℃加熱有利于輻照魚糜內源性TGase發揮催化作用，促進魚糜的凝膠化作用。

2.3 電子束輻照對帶魚魚糜TGase二級結構的影響

2.3.1 傅里葉變換紅外光譜分析結果

圖2 TGase的傅里葉變換紅外光譜圖Fig. 2 Fourier transform infrared spectra of TGase

紅外光譜在多個波段對蛋白質分子中的化學基團具有特征吸收帶，可以反映蛋白質的二級結構信息[29-31]。由圖2可知，各組魚糜TGase在紅外區出現若干個特征吸收峰，其中1 051 cm-1左右處吸收峰代表分子中的C—O伸縮振動；1 515～1 570 cm-1為酰胺II帶的特征吸收區域，由60%的N—H彎曲振動和40%的C—N伸縮振動引起；1 600～1 700 cm-1為酰胺I帶的吸收峰，譜峰指認比較成熟，其對應關系分別為β-折疊（1 610～1 639 cm-1）、無規卷曲（1 640～1 650 cm-1）、α-螺旋（1 651～1 660 cm-1）、β-轉角（1 661～1 670 cm-1），酰胺I帶的吸收峰能較好地反映蛋白質的二級結構；3 300 cm-1左右為酰胺A帶的吸收峰，波數的變化與酶分子中氫鍵的變化有關[32]。通常高溫或輻照等處理會破壞分子內的氫鍵作用，影響蛋白質的二級結構單元，使得峰位遷移。

表3 TGase二級結構相對含量（傅里葉變換紅外光譜）Table 3 Secondary structure fractions of TGase (Fourier transform infrared spectroscopy)

與對照組相比，輻照組魚糜TGase在紅外區的特征吸收峰發生不同程度偏移，其中酰胺I帶峰由高波數（1 654 cm-1）向低波數（1 649 cm-1）移動，可見電子束輻照改變了魚糜TGase的空間結構，分子中的二級結構單元組成發生了變化。對酰胺I帶進行高斯曲線擬合分析，根據積分面積計算TGase二級結構的相對含量，結果見表3。TGase中α-螺旋和無規卷曲相對含量最高，β-折疊相對含量最低。結合圖2，輻照組魚糜TGase酰胺I帶峰由高波數向低波數移動，分子中部分α-螺旋轉變為無規卷曲、β-折疊等結構，尤其在5 kGy組最為明顯，這與表3中5 kGy組α-螺旋相對含量達最低值（27.11%），無規卷曲相對含量達最大值（34.18%）相一致。

2.3.2 圓二色光譜分析結果

圖3 TGase的圓二色光譜圖Fig. 3 Circular dichroism spectra of TGase at different irradiation doses

圖4 TGase的二級結構相對含量（圓二色光譜）Fig. 4 Secondary structure fractions of TGase determined by circular dichroism spectroscopy

不同劑量輻照帶魚魚糜TGase的圓二色光譜結果見圖3，各二級結構的相對含量見圖4。圓二色光譜與傅里葉變換紅外光譜所表征的TGase二級結構相對含量的變化趨勢一致，具體數值的差異可能是由于計算方法存在差別。由圖4可知，輻照劑量低于5 kGy時，隨著輻照劑量的增加TGase中α-螺旋相對含量減少，β-折疊和無規卷曲相對含量增加，超過5 kGy則相反。至5 kGy時TGase二級結構中α-螺旋相對含量達最小值，而β-折疊及無規卷曲相對含量達最大值。說明低于5 kGy輻照劑量可以促使α-螺旋轉化為β-折疊和無規卷曲。

結合輻照處理對TGase活力的影響，推測輻照導致酶蛋白結構的變化，在一定劑量下，α-螺旋中規則有序的氫鍵穩定性遭到破壞，展開的多肽鏈暴露出更多的基團，在分子重新聚集時部分形成β-折疊，部分轉變為無規卷曲，而這種變化有利于酶活性基團的暴露并進一步和底物結合。Cao Hongwei等[33]將TGase添加到魚糜中，發現微波加熱20 min時TGase活力及魚糜凝膠強度最大，并認為TGase活性的增加與其α-螺旋含量下降有關；顧可飛[12]發現當輻照劑量超過4.83 kGy時，隨著電子束輻照劑量的增加，多酚氧化酶α-螺旋、β-折疊和β-轉角含量不斷下降，而無規卷曲含量上升；Herrero等[29]用8 kGy電子束輻射鮭魚肉，發現魚肉蛋白的α-螺旋比例顯著下降，而β-折疊、β-轉角和無規卷曲比例增多；Lee等[34]在分析γ射線對肌紅蛋白結構的影響時，也發現隨劑量的升高，肌紅蛋白α-螺旋含量降低，無規卷曲含量升高?？梢姡椪諏Υ蠖鄶档鞍讈碚f，會破壞其有序的構象單元，增加無規卷曲的含量。

2.4 電子束輻照對帶魚魚糜凝膠強度和保水性的影響

圖5 電子束輻照對帶魚魚糜凝膠強度和保水性的影響Fig. 5 Effect of EB irradiation on gel strength and water-holding capacity of surimi gel

如圖5所示，輻照后魚糜凝膠強度和保水性均顯著高于對照組（P＜0.05），并在5 kGy處理組達到最大值，分別為875 g·cm和94.30%，顯著高于對照組（380 g·cm和82.00%），這與5 kGy劑量處理能顯著提升帶魚魚糜TGase活性相一致。電子束輻照會對帶魚魚糜內源性TGase產生影響，提升或降低魚糜凝膠強度，同時輻照也會引起魚糜肌原纖維蛋白、其他內源性酶發生變化，從而影響魚糜凝膠的形成。本實驗室在輻照對魚糜凝膠特性的研究中，也發現適宜劑量（5～7 kGy）的輻照處理會改變魚糜蛋白分子的交聯度，使其凝膠網狀結構更加緊密，同時也能通過抑制魚糜內源性肌原纖維結合型絲氨酸蛋白酶和組織蛋白酶L的活性，減輕對肌原纖維蛋白的降解作用，從而起到防止凝膠劣化、增強其凝膠強度和保水性的作用[9,13,17]。電子束輻照對魚糜凝膠強度和保水性等宏觀凝膠特性的影響，是魚糜中肌原纖維蛋白、內源性酶等微觀分子結構變化的綜合結果。

3 結 論

電子束輻照處理對帶魚魚糜內源性TGase的酶學特性產生影響，隨著輻照劑量由1 kGy增加到9 kGy，TGase活力呈現先上升后降低，5 kGy劑量處理能顯著提升魚糜TGase活性，輻照不影響TGase的最適反應pH值，除9 kGy處理組外，各組魚糜TGase的最適反應溫度均為40 ℃。為形成更好的魚糜凝膠，通常采用二段式加熱，低溫段溫度設置為40 ℃有利于TGase發揮最適作用；輻照引起魚糜TGase分子中的二級結構單元轉變，導致其構象變化，適宜劑量電子束輻照能使TGase酶蛋白分子中結構相對緊密的α-螺旋和β-轉角結構轉化為較松散的β-折疊及無規卷曲，有利于TGase活性基團的暴露，有效提高魚糜TGase活性，促進帶魚魚糜凝膠的形成。